2019, Vol. 39 
金花葵（Aurea helianthus）为锦葵科秋葵属一年生草本植物，别名野芙蓉、菜芙蓉、黏干或山榆皮，花具有药用、食用、保健等功能，其主要成分为黄酮类、维生素E、有机酸、不饱和脂肪酸、微量元素等。其中金花葵黄酮类成分具有良好的抗炎镇痛，降血脂降压，降血糖，抑制肿瘤细胞，调节免疫功能，抗氧化等药理作用[1-5]；有机酸类成分具有抗氧化，抗病毒，抗肿瘤，抗血小板凝集，抑菌，镇痛，抑制糖尿病，保护神经系统，保护心血管系统等多种药理活性，具有较高的药用价值[6-9]。
超高效液相色谱-串联质谱联用技术（UPLC-MS/MS）具有分析速度快，检测灵敏度高，抗干扰能力强等特点，可以有效降低复杂样品中的基体干扰，提高检测的准确性，为中药材的多组分快速分析提供有力的技术支持[10-13]。现有研究主要集中于金花葵药材中总黄酮的研究，关于多组分定量测定研究相对较少[14-19]，而采用UPLC-MS/MS同时测定金花葵中黄酮类和有机酸类等11个活性成分的研究未见报道。本研究采用UPLC-MS/MS技术，建立对8批金花葵药材中没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷、杨梅素、槲皮素11个成分的同步含量测定，该方法简便快速准确，对于金花葵药材的质量控制研究具有重要意义，为进一步探究该药材药效活性物质作用机制研究提供科学依据。
1 仪器与试药赛默飞Q ExactiveTM Plus组合型四极杆OrbitrapTM高分辨质谱仪（Thermo Fisher Scientific公司，配备ESI离子源，SieveTM2.2工作站），UltiMate3000超高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific公司），Shimadzu LIBROR L-160DTP万分之一天平（岛津公司），METTLER AE240十万分之一天平（梅特勒-托利多上海仪器有限公司），SB-5200DT型数控超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。
对照品没食子酸（批号wkq16120802）、绿原酸（批号wkq16052705）、芦丁（批号wkq16031602）、异槲皮苷（批号wkq16040703）、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷（批号wkq17030704）、槲皮素（批号wkq16063005）均购于四川维克奇生物科技有限公司，HPLC-DAD（面积归一化法）检测纯度均大于98.0%；原儿茶酸（批号MUST-16032112，纯度以99.48%计）、咖啡酸（批号MUST-16060613，纯度以99.99%计）、金丝桃苷（批号MUST-16102605，纯度以99.76%计）购于成都曼思特生物科技有限公司，以HPLC-DAD（面积归一化法）检测纯度；棉皮素（批号Z21N8H47448，纯度≥98.5%）、杨梅素（批号YM0311YA13，纯度≥98.0%）购于上海源叶生物科技有限公司，以HPLC-DAD（面积归一化法）检测纯度。
甲醇、乙腈为色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；甲酸为色谱纯，西格玛奥德里奇（中国）有限公司；水为超纯水；8批金花葵药材产地分别为河南洛阳、河南开封、河南南阳、河南平顶山、河南新乡、安徽亳州、江苏南京、四川成都，分别标号为A~H。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Waters ACQUITY BEN C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱；流动相为0.05%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~2 min，5%B→17%B；2~20 min，17% B→45%B；20~21 min，45% B→75%B；21~22 min，75%B），流速0.2 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量2 μL。
2.2 质谱条件采用电喷雾离子源（ESI源），以正、负离子模式同时检测，全扫模式（Full MS/dd-MS2），离子源温度350 ℃，喷雾电压3.50 kV，鞘气压力276 kPa，辅助气流量3 L·min-1，毛细管温度350 ℃，S-lens RF水平55.0，扫描范围为m/z100~1 000。11个活性成分经比较，确定负离子模式较好，质谱检测参数见表 1，提取的定量离子色谱图见图 1。
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1.没食子酸（gallic acid）2.原儿茶酸（protocatechuic acid）3.绿原酸（chlorogenic acid）4.咖啡酸（caffeic acid）5.芦丁（rutin）6.金丝桃苷（hyperin）7.异槲皮苷（isoquercitrin）8.棉皮素（hibifolin）9.槲皮素-3’-O-葡萄糖苷（quercetin-3’-O-glucoside）10.杨梅素（myricetin）11.槲皮素（quercetin） 图 1 对照品（A）和金花葵样品（B）的提取定量离子色谱图 Fig.1 Extracting quantitative ion chromatograms of reference substances(A)and Aurea helianthus samples(B) |
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表 1 金花葵中11个活性成分的质谱参数 Tab.1 The mass parameters of 11 constituents in Aurea helianthus |
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表 2 金花葵中11个成分的线性回归方程 Tab.2 Linear regression equations of 11 components |
取金花葵样品粉末（过65目筛）0.1 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加甲醇20 mL，称量，超声（功率300 W，频率40 kHz）提取30 min，放置至室温，再称量，用甲醇补足损失的量，滤过，取续滤液，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.3.2 对照品储备液分别精密称取对照品没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷、杨梅素、槲皮素适量，用甲醇配制成质量浓度分别为3.830、5.500、18.00、3.330、794.0、1 088、716.0、3038、728.0、281.0、90.80 μg·mL-1的对照品储备液，置于4℃冰箱备用。
2.3.3 混合对照品储备液精密吸取各对照品储备液适量，用甲醇配制成质量浓度分别为没食子酸0.153 2 μg·mL-1、原儿茶酸0.220 0 μg·mL-1、绿原酸0.720 0 μg·mL-1、咖啡酸0.133 2 μg·mL-1、芦丁31.76 μg·mL-1、金丝桃苷43.52 μg·mL-1、异槲皮苷28.64 μg·mL-1、棉皮素121.5 μg·mL-1、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷29.12 μg·mL-1、杨梅素11.24 μg·mL-1、槲皮素3.632 μg·mL-1的混合对照品储备液。
2.4 线性关系考察精密量取“2.3.3”项下不同体积的对照品储备液，用甲醇稀释成系列质量浓度的混合对照品溶液，按照“2.1”和“2.2”项下色谱-质谱条件进样测定。以各成分的质量浓度（X）为横坐标，以各成分的峰面积均值（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表 2。
2.5 精密度试验精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，计算各组分峰面积的RSD，分别为没食子酸1.2%、原儿茶酸2.0%、绿原酸1.6%、咖啡酸1.0%、芦丁0.66%、金丝桃苷0.93%、异槲皮苷0.45%、棉皮素1.1%、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷1.2%、杨梅素0.75%、槲皮素1.1%，表明仪器的精密度良好。
2.6 重复性试验精密称取同一批金花葵样品（批次E）6份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，分别进样，测得没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷、杨梅素、槲皮素11个成分的平均含量分别为0.038、0.061、0.213、0.010、3.838、6.509、4.442、17.518、4.363、0.798、0.676 mg·g-1，RSD分别为1.8%、2.0%、2.7%、2.0%、1.3%、1.1%、0.89%、1.9%、0.63%、2.3%、1.3%，表明该方法重复性良好。
2.7 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液（批次E），室温放置，于0、2、4、6、8、10、12、24 h分别进样测定，计算各组分峰面积的RSD，分别为没食子酸1.0%、原儿茶酸1.2%、绿原酸0.56%、咖啡酸1.3%、芦丁1.1 %、金丝桃苷0.47%、异槲皮苷1.1%、棉皮素1.7%、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷1.7%、杨梅素1.4%、槲皮素0.86%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 加样回收率试验精密称取已测知含量的同一批次金花葵样品（批次E）6份，约0.05 g，分别精密加入11个对照品的混合对照品溶液适量，按照“2.3.1”项下方法制备供试溶液，进样测定，计算回收率，结果见表 3。
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表 3 回收率测定结果（n=6） Tab.3 Results of recovery of 11 constituents in Aurea helianthus |
8批不同产地的金花葵样品，按“2.3.1”项下方法制备供试溶液，按照“2.1”和“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积，计算各成分含量，结果见表 4。
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表 4 金花葵中11个化学成分定量测定结果（n=3，mg·g-1） Tab.4 Quantitative determination of 11 components in Aurea helianthus |
实验考察了Thermo Syncronis C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和Waters ACQUITY BEN C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），结果表明，后者能很好地分离金花葵中的有效成分，分离度高且峰形较好，最终选用Waters ACQUITY BEN C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。
3.2 流动相的选择实验分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.05%甲酸水等流动相体系，结果表明，乙腈-0.05%甲酸水为流动相时色谱峰峰形最好，分离度最高。由于本实验同时测定11个活性成分，其极性有较大差别，为了获得所有色谱峰且缩短分析时间，故选用梯度洗脱。
3.3 小结本实验建立了UPLC-MS/MS法同时测定金花葵药材中黄酮类成分芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷、杨梅素、槲皮素，以及有机酸类成分没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸等11个活性成分的含量，方法简便、快速、准确，灵敏度高，重现性好，可用于金花葵药材中主要活性成分的含量测定，为进一步探究该药材药效活性物质作用机制研究提供科学依据。
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