2019, Vol. 39 
2. 浙江中医药大学附属第一医院, 杭州 310006
2. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China
骨质疏松是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。中医理论认为骨质疏松的发生主要与肾虚、脾虚、血瘀3个因素有关，其中肾虚是最主要的病因，中医对骨质疏松的治疗原则主要有补肾壮骨、补肾健脾、补肾活血、补肾疏肝[1]。淫羊藿、杜仲均为补肝肾的常用中药，强壮筋骨疗效显著。淫羊藿的主要成分淫羊藿总黄酮，能调节人体骨保护素和骨保护素配体的基因表达水平，达到保护骨细胞的作用；杜仲的主要成分杜仲总黄酮能防止骨质流失和骨小梁结构恶化，促进矿物质化，增加骨密度，改善骨小梁微体结构[2-6]；两者合用，能显著增强其补肾壮骨的功效，临床研究表明，淫羊藿配伍杜仲治疗骨质疏松症患者疗效明显，可以有效提高患者骨密度，改善疼痛程度。而现有文献报道尚未见杜仲-淫羊藿药对多成分含量测定以及配伍对各成分含量影响的研究，本文研究建立了同时测定杜仲-淫羊藿药对中绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ 8个成分的HPLC含量测定方法，可用于杜仲-淫羊藿药对及其制剂的质量评价及质量控制，并分析比较配伍前后各成分含量的变化，可为杜仲、淫羊藿配伍对有效成分溶出、对药效作用的影响以及配伍机制等后续研究奠定基础。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1200高效液相色谱仪（安捷伦公司，配备G1322A在线脱气机、G1311A四元梯度泵、G1329A自动进样仪、G1316A柱温箱、G1315D二极管阵列检测器、Agilent色谱工作站）；Mettler XS105DU电子分析天平（十万分之一，梅特勒公司）；Sartorious BS110S电子分析天平（万分之一，德国赛多利斯公司）；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；FZ102型微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PHS-3TC精密数显酸度计（上海天达仪器有限公司）；手动移液器（Eppendorf公司）。
1.2 实验试剂与试药杜仲饮片分别购自浙江天道医药有限公司（批号171001、170501）、浙江桐君堂中药饮片公司（批号171025），淫羊藿饮片分别购自浙江天道医药有限公司（批号170501）、华东医药有限公司（批号171126）、浙江钱王中药有限公司（批号1703015），经浙江中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定为正品，符合2015年版《中华人民共和国药典》（一部）项下规定；其中淫羊藿为产自甘肃、四川的柔毛淫羊藿，杜仲产自浙江、安徽；绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷的对照品购自中国食品药品检定研究院（纯度 > 98%，批号分别为0753-200111、110885-200102、111537-200501），朝藿定A、淫羊藿苷的对照品购自上海源叶生物科技有限公司（纯度 > 98%，批号分别为110623-7-28、489-31-7），朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷Ⅰ的对照品购自成都曼斯特生物科技有限公司（纯度 > 98%，批号分别为MUST-17071403、MUST-17080705、MUST-17042203），甲醇（色谱纯，TEDIA）、乙腈（色谱纯，MERCK），水为娃哈哈纯净水，异丙醇（色谱纯），磷酸、甲醇等试剂均为分析纯。
2 实验方法 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品溶液分别取绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的对照品适量，精密称定，以甲醇配制成质量浓度为2.255、2.724、2.753、1.997、2.199、2.209、1.925、2.268 mg·mL-1的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液，绿原酸58 µL、松脂醇二葡萄糖苷38 µL、朝藿定A 60 µL、朝藿定B 72 µL、朝藿定C 62 µL、淫羊藿苷196 µL、宝藿苷Ⅰ20 µL以及咖啡酸储备液稀释10倍的溶液24 µL，置于1 mL棕色量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ质量浓度分别为130.8、6.538、104.6、119.8、158.3、137.0、377.3、45.36 µg·mL-1的混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液取杜仲（过40目筛）、淫羊藿（过50目筛）饮片，各约0.4 g，精密称定，置于锥形瓶中，加25倍量75%甲醇，30 ℃超声（功率200 W，频率40 kHz）提取60 min，冷却至室温，用溶剂补足减失的量，过滤，取续滤液于4 ℃、12 000 r·min-1高速冷冻离心15 min，取上清液，即得。
2.1.3 对照溶液分别取杜仲、淫羊藿饮片粉末各约0.4 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法分别制成杜仲对照溶液、淫羊藿对照溶液。
2.2 色谱条件及系统适用性试验色谱柱：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~15 min，11%A；15~20 min，11%A→18%A；20~21 min，18%A→23%A；21~48 min，23%A；48~49 min，23%A→42%A；49~60 min，42%A）；检测波长：320 nm（咖啡酸、绿原酸），277 nm（松脂醇二葡萄糖苷），270 nm（朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C），280 nm（淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：5 μL。在此色谱条件下，各检测成分均达到基线分离，理论塔板数均大于2 000。
3 方法学考察 3.1 专属性试验精密吸取混合对照品溶液、杜仲-淫羊藿供试品溶液及杜仲、淫羊藿的对照溶液各5 μL，按“2.2”项下色谱条件进样测定，得相应的色谱图，如图 1所示。供试品溶液在绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品相应的位置上均有相同保留时间的色谱峰，杜仲对照溶液在朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ相对应的位置没有色谱峰，淫羊藿对照溶液在松脂醇二葡萄糖苷相对应的位置没有色谱峰，而绿原酸与咖啡酸为杜仲和淫羊藿的共有成分，说明杜仲-淫羊藿药对中其他成分对8个成分的检测不产生干扰，方法专属性好。
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1.绿原酸（chlorogenic acid）2.咖啡酸（caffeic acid）3.松脂醇二葡萄糖苷（pinoresinol diglucoside）4.朝藿定A（epimedin A）5.朝藿定B（epimedin B）6.朝藿定C（epimedin C）7.淫羊藿苷（icariin）8.宝藿苷I（baohuoside I） 图 1 混合对照品溶液（A）、供试品溶液（B）、杜仲对照溶液（C）、淫羊藿对照溶液（D）的HPLC图 Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substance solution(A), sample solution(B), Eucommiae Cortex reference solution(C)and Epimedii Folium reference solution(D) |
精密吸取各对照品储备液，绿原酸280 µL、咖啡酸12 µL、松脂醇二葡萄糖苷184 µL、朝藿定A 288 µL、朝藿定B 344 µL、朝藿定C 296 µL、宝藿苷Ⅰ96 µL，置于2 mL棕色量瓶中，另精密吸取淫羊藿苷对照品储备液1250 µL，置于2 mL棕色量瓶中，均加甲醇定容至刻度，摇匀，得绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷Ⅰ质量浓度分别为315.7、16.34、253.3、287.6、378.2、326.9、108.9 μg·mL-1的混合对照品溶液及质量浓度为1 203 μg·mL-1淫羊藿苷溶液；取上述2种溶液适量，加甲醇逐级稀释2、4、8、16、32倍，摇匀，按“2.2”项下所色谱条件分别进样5 μL，以各成分的峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，进行线性回归，结果见表 1，8个成分均在定量测定范围内线性关系良好。
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表 1 线性关系考察结果（n=3） Tab.1 The results of linear relation |
精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液，在上述色谱条件下连续重复进样6次，记录峰面积并计算峰面积的RSD。结果绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ峰面积的RSD分别为0.67%、0.76%、0.57%、0.68%、0.73%、1.4%、0.78%、0.51%，均符合要求，仪器精密度良好。
3.4 稳定性试验取杜仲-淫羊藿供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h在上述色谱条件下进样测定，记录峰面积并计算RSD。48 h内绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ峰面积的RSD分别为0.64%、0.73%、2.0%、0.78%、0.56%、1.7%、2.2%、2.9%。说明供试品溶液在48 h内稳定。
3.5 重复性试验取同一批次杜仲（171001）、淫羊藿（170501）饮片粉末6份，每份各约0.4 g，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，在上述色谱条件下外标两点法进样测定。结果绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ 8个成分的平均含量分别为3.286、0.164、2.652、3.033、3.964、3.465、9.432、1.107 mg·g-1，RSD分别为1.5%、1.6%、1.0%、1.7%、2.0%、2.4%、2.0%、1.6%，表明该方法的重复性良好。
3.6 加样回收试验取已测定含量的杜仲（171001）、淫羊藿（170501）饮片6份，每份各约0.1 g，精密加入等同于样品量的8个对照品储备液，按“2.1.2”项下方法制成供试溶液，在上述色谱条件下进样测定，计算回收率及RSD，结果见表 2。绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ 8个成分的平均加样回收率及RSD均符合要求。
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表 2 加样回收率试验结果（n=6） Tab.2 Results of recovery tests |
取3个批次的杜仲、淫羊藿饮片，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，以外标两点法计算样品中各成分的含量，结果见表 3。杜仲-淫羊藿药对中绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ含量分别为2.623~3.210、0.148 1~0.162 3、1.968~2.544、2.257~2.910、3.660~3.789、3.888~4.998、7.323~9.220、0.875 3~1.208 mg·g-1。
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表 3 样品的含有量测定结果（mg·g-1，x±s，n=3） Tab.3 Results of content determination |
采用SPSS 17.0统计软件分析3批杜仲、淫羊藿饮片配伍后8个成分含量的变化，发现配伍后绿原酸、咖啡酸、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的含有量均有不同程度的减少，朝藿定B含有量有不同程度的增加，松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定C含有量无明显变化。
4 讨论 4.1 含量测定成分的选择2015年版《中华人民共和国药典》明确规定了松脂醇二葡萄糖苷为杜仲饮片含量测定项下的指标成分，淫羊藿苷与宝藿苷Ⅰ为淫羊藿饮片含量测定项下的指标成分绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷均为杜仲的主要功效成分，绿原酸具有促进大鼠成骨细胞增殖的作用，咖啡酸能够直接抑制破骨细胞的形成与分化，松脂醇二葡萄糖苷具有降低骨钙素和碱性磷酸酶含量的作用；而朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ则为淫羊藿的黄酮类成分，淫羊藿总黄酮对体外成骨细胞增殖和分化成熟具有良好的促进作用，临床常将两者配伍用于治疗骨质疏松、骨关节炎等骨科疾病[7-9]。故本文选择绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ为杜仲-淫羊藿药对的质量评价的指标。
4.2 色谱条件的优化对上述8个成分采用紫外二极管阵列检测器进行光谱扫描，结果显示，绿原酸和咖啡酸的最大吸收波长为320 nm，松脂醇二葡萄糖苷的最大吸收波长为277 nm，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ为270 nm[10-13]，实验中发现选用270 nm测定淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ时，待测色谱峰前均有一小峰，不能达到基线分离，不利于含量测定，而改为280 nm测定淫羊藿苷与宝藿苷Ⅰ时，所产生的紫外吸收干扰较小，各成分分离良好，故淫羊藿苷与宝藿苷Ⅰ两个成分的检测波长确定为280 nm。考虑到8个成分紫外最大吸收波长相差较大，为了提高检测灵敏度，本文采用了梯度洗脱-波长切换技术，分别在各个组分的出峰时间段选择最适吸收波长作为检测波长，实现了8个成分均在其最适吸收波长下同时测定。
4.3 样品前处理工艺的选择利用单因素考察法，对提取方法，提取溶剂，溶剂倍量，药材粒径，提取时间五个因素进行了考察，综合对比了各个不同条件下样品中的有效成分含量后，最终确定了“2.1.2”项下方法作为供试品溶液的制备方法。
5 结论本文首次建立了同时测定杜仲-淫羊藿药对中绿原酸、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ8个成分含量的分析方法，操作简便，专属性好，结果准确可靠，提供了多指标综合评价杜仲-淫羊藿药对及其制剂内在质量的分析方法，结合配伍前后各成分含量的变化，可为杜仲-淫羊藿药对的临床配伍应用以及配伍对其化学成分溶出、对药效的影响及配伍机制等后续研究提供科学依据。
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