2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 北京市药品检验所中药成分分析与生物评价北京市重点实验室, 北京 102206
2. Beijing Institute for Drug Control, Beijing Key Laboratory of Analysis and Evaluation on Chinese Medicine, Beijing 102206, China
甘草作为我国最常用的大宗药材，素有“国老”、“十方九草”之称[1]，始载于《神农本草经》，具有补脾益气、祛痰止咳、清热解毒、缓急止痛、调和诸药等功效。甘草中的活性成分主要包括三萜皂苷类和黄酮类化合物。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）自2005年版开始，除甘草酸外，新增甘草苷作为甘草药材的质量标准。2015年版[2]《中国药典》明确规定，甘草干燥品中以甘草苷C21H22O9计的含量不得低于0.5%，从而确定了黄酮类化合物在评价甘草质量时的重要地位，黄酮类化合物逐渐成为甘草开发研究中的新热点。
目前，甘草中已发现的黄酮类化合物有300多种，结构类型几乎包括了除花青素外的所有黄酮小类，其中二氢黄酮和查尔酮类是最具代表性的类型[3]，二氢黄酮类如甘草素、甘草苷、芹糖甘草苷等，查耳酮类如异甘草素、异甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草查尔酮A等。甘草素与异甘草素、甘草苷与异甘草苷、芹糖甘草苷与芹糖异甘草苷为3对同分异构体。自日本学者Takagi等[4]研究发现甘草中发挥抗溃疡作用的活性成分为黄酮类化合物以来，甘草黄酮类化合物的药理活性逐渐受到关注。现代药理学研究显示，甘草黄酮类化合物具有抗癌[5-6]、抗炎[7-8]、抗氧化[9]、抗真菌[10]、神经系统保护[11]、降糖保肝[12-13]等药理活性。因此，建立甘草中黄酮类化合物的快速、准确测定方法对于评价甘草的质量、临床使用及新药开发均具有重要意义。
本课题组前期曾建立了同时测定甘草中4个主要黄酮类化合物含量的HPLC方法[14]，但一方面HPLC测定时间长，每批样品需要40 min左右，效率较低，另一方面测定的黄酮类化合物种类有限，而芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷以及甘草查尔酮A在甘草样品中含量水平较高，且发挥着众多药理活性，不容忽视，因此，有必要建立高效的测定方法对甘草药材中的黄酮类化合物进行更为全面的评价。此外，2015年版《中国药典》[2]规定甘草药材来源于3种基原植物，即乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、光果甘草Glycyrrhiza glabra L.及胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.，然而，本课题组前期对四大药材市场的市售甘草进行了深入的调查研究，发现市售甘草均为乌拉尔甘草及光果甘草，未检出胀果甘草[15]。因此，本文以市售的两年生乌拉尔甘草和光果甘草为实验材料[15]，拟建立同时测定甘草药材中7个黄酮类化合物的超高效液相色谱（UPLC）方法，以便能快速、全面地反映甘草中黄酮类化合物的分布，准确地评价其质量。
1 仪器、试剂及样品 1.1 实验仪器Waters Acquity UPLC色谱系统，配备Acquity UPLC eλ检测器；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；十万分之一CPA225D电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；超声清洗仪KQ-250E（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试剂对照品甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷批号分别为MUST-15021104、MUST-15042010、MUST-15082811、MUST-15031204，纯度分别为99.07%、98%、98.5%、99.99%，均购于成都曼思特生物科技有限公司；对照品芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草查尔酮A批号分别为16080303、17051503、151015，纯度均为98%，均购于成都普菲德生物技术公司。甲醇与乙腈为色谱纯，购于Merck公司；磷酸为分析纯，购于北京化工试剂有限公司；实验用水为屈臣氏蒸馏水。
1.3 样品实验所用样品为市售乌拉尔甘草、光果甘草各20份，采用本课题组前期建立的分子鉴定方法[15]对其进行鉴定。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0~1.36 min，14%B→23%B；1.36~3.26 min，23%B→30%B；3.26~4.08 min，30%B→34%B；4.08~4.76 min，34%B→36%B；4.76~5.71 min，36%B→42%B；5.71~6.53 min，42%B→51%B；6.53~9 min，51%B），流速为0.3 mL·min-1；276 nm波长检测甘草素、甘草苷、芹糖甘草苷，360 nm波长检测异甘草苷、芹糖异甘草苷，370 nm波长检测异甘草素，380 nm波长检测甘草查尔酮A；柱温40 ℃；进样量1 μL。
2.2 混合对照品溶液的制备分别精密称取对照品适量，加入50%甲醇水溶液制成每1 mL分别含芹糖甘草苷80.4 μg、甘草苷135 μg、芹糖异甘草苷31.4 μg、异甘草苷208 μg、甘草素71.3 μg、异甘草素0.782 μg、甘草查尔酮A 8.58 μg的混合对照品溶液，备用。
2.3 供试品溶液的制备精密称定0.1 g样品粉末（过60目筛），置于50 mL量瓶中，加入50%甲醇水溶液定容，密塞，超声（频率50 kHz，功率250 W）提取30 min，放冷，用50%甲醇水溶液补至刻度，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液为供试品溶液。
2.4 线性关系考察分别精密量取“2.2”项下混合对照品溶液适量，用甲醇分别稀释至6个不同浓度，注入UPLC色谱仪检测。以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程，结果见表 1。
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表 1 分析物的回归方程、检测下限及定量下限 Tab.1 Regression equation, LOD and LOQ of seven analytes |
分别精密量取甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草查尔酮A质量浓度分别为0.714、0.077 6、12.9、1.76、8.44、2.70、0.911 μg·mL-1的单一成分对照品溶液适量，按浓度稀释法进行分析，以信噪比3:1时测得的量为检测下限，以信噪比10:1时测得的量为定量下限。结果见表 1。
2.6 精密度试验取乌拉尔甘草HB15号样品粉末5份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，计算得甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草查尔酮A峰面积的RSD分别为0.94%、1.0%、0.19%、0.46%、0.27%、0.32%、0.68%，表明仪器的精密度良好。
2.7 稳定性试验取乌拉尔甘草HB15号样品粉末，按“2.3”项方法制备供试品溶液，在室温下保存，分别于0、2、4、6、8、10 h进样测定，计算得甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草查尔酮A峰面积的RSD分别为0.89%、0.21%、0.19%、0.36%、0.17%、0.22%、0.75%，表明供试品溶液在10 h内基本稳定。
2.8 重复性试验取乌拉尔甘草HB15号样品粉末5份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，依次测定7个黄酮成分，结果甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草查尔酮A含量分别为0.372、0.045 7、6.83、1.20、3.92、1.89、0.505 mg·g-1，RSD分别为0.87%、1.9%、0.19%、0.42%、0.23%、0.29%、1.4%，表明本方法重复性良好。
2.9 加样回收率试验精密称定已知含量的乌拉尔甘草HB7号样品粉末0.1 g 9份，分别置于50 mL量瓶中，分别精密加入低、中、高3个浓度的混合对照品溶液，每个浓度3个重复，按“2.3”项方法制备溶液，按“2.1”项色谱条件测定，计算加样回收率。结果见表 2。
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表 2 7个黄酮成分加样回收试验 Tab.2 Results of recovery tests for seven flavonoids |
分别调节流动相比例、流速、柱温发生微小变化，测定同一供试样品含量，结果表明，在流动相比例变化为±2%，流速为（0.3±0.1）mL·min-1，色谱柱温度为（40±5）℃，流动相比例、流速、柱温对测定结果无显著影响。
2.11 样品测定取乌拉尔甘草和光果甘草各20份，按照“2.3”项方法制备供试品溶液。分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液各1 μL进行测定。色谱峰图见图 1。根据外标法计算出甘草中的7个黄酮类成分的含量，见表 3。
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表 3 2种不同基原甘草样品中7个黄酮类成分的含量(mg·g-1，n=20) Tab.3 The contents of seven flavonoids in G. uralensis and G. glabra samples |
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1.芹糖甘草苷（liquiritin apioside）2.甘草苷（liquiritin）3.芹糖异甘草苷（isoliquiritin apioside）4.异甘草苷（isoliquiritin）5.甘草素（liquiritigenin）6.异甘草素（isoliquiritigenin）7.甘草查尔酮A（licochalcone A）A.混合对照品（mixed reference substances）B.乌拉尔甘草样品（G. uralensis sample）C.光果甘草样品（G. glabra sample） 图 1 混合对照品及2种不同基原甘草样品的UPLC色谱图 Fig.1 The UPLC chromatograms of mixed reference substances and two original plants of licorice |
运用SAS 9.4分析软件中的Spearman相关性分析，对乌拉尔甘草及光果甘草中的3对同分异构体：甘草素与异甘草素、甘草苷与异甘草苷、芹糖甘草苷与芹糖异甘草苷的含量进行相关性分析，结果如表 4所示。由结果可知，乌拉尔甘草中3对同分异构体的含量相关性均显著；光果甘草中甘草苷与异甘草苷含量的相关性不显著，其他2对同分异构体的含量相关性均显著。运用SAS 9.4分析软件中的非参数检验对2种基原甘草中的7个黄酮类化合物含量进行差异性分析（Wilcoxon Two-Sample Test），结果见表 5。由结果可知，在乌拉尔甘草与光果甘草间甘草苷、异甘草苷、甘草素的含量存在显著差异。
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表 4 2种不同基原甘草样品中3对同分异构体含量相关性分析 Tab.4 The correlation analysis of the contents of liquiritin and isoliquiritin, liquiritigenin and isoliquiritigenin, liquiritin apioside and isoliquiritin apioside in G. uralensis and G. glabra samples |
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表 5 2种不同基原甘草样品中7个黄酮类成分含量的差异性分析（P < 0.05） Tab.5 Wilcoxon two-sample test of the contents of seven flavonoids in G. uralensis and G. glabra samples |
本实验曾试用过乙腈-甲酸、乙腈-乙酸、乙腈-磷酸等流动相系统，其中以乙腈-磷酸流动相的分离效果最佳，通过进一步优化，确定了本文的实验条件，以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，各成分的色谱峰分离效果良好，稳定可行。
3.2 提取方法的考察本实验曾以50%甲醇水溶液为溶剂，对回流萃取和超声提取方式进行考察，结果表明2种提取方法无明显差异，故选择较为简便省时的超声提取方式。此外，对30%、50%、70%甲醇水及乙醇溶液分别进行考察，其中以50%甲醇水溶液为提取溶剂时，各成分的提取效果最佳。同时，分别对30、50、70 min的提取时间进行考察，结果表明无明显差异，为省时节约成本，故选择30 min为提取时间。
3.3 不同基原甘草中7个黄酮类化合物的含量比较甘草素、异甘草素、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷和甘草查尔酮A均是甘草中的主要活性成分，是甘草发挥抗肿瘤、抗炎、抗氧化、神经系统保护作用的关键成分[16-19]。除甘草查尔酮A外，乌拉尔甘草中的其他6个黄酮类成分的含量均高于光果甘草，说明乌拉尔甘草是提取甘草黄酮类化合物的优质基原植物。此外，乌拉尔甘草与光果甘草中的甘草素与异甘草素、芹糖甘草苷与芹糖异甘草苷的含量均有显著相关关系，表明这2对同分异构体在生物合成的代谢通路上具有相关性，值得进一步研究。
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