2019, Vol. 39 
2. 珠海津之敦医药科技有限公司, 珠海 519000
2. Zhuhai Oxforston Pharmtech Co., Ltd., Zhuhai 519000, China
罗红霉素（roxithmycin），分子式为C41H76N2O15，化学名9-[O-[2-（甲氧基乙氧基）-甲基]-肟]，为半合成的14元大环内酯抗生素，是红霉素的衍生物。在临床上主要应用于由革兰氏阳性菌引起的呼吸道、泌尿道、皮肤和软组织感染的治疗。在酸性介质中较高的稳定性，使其表现出良好的药代动力学性质。但由于其疏水性强，在水中的溶解度低，属于BCS 2类（低溶解度-高通透性）药物，因此，药物的溶出速率为其在体内吸收的限速步骤[1]。
影响口服固体制剂溶出的因素有原料药粒径、晶型、辅料、制剂处方和生产工艺等。同一固体原料药在不同的合成工艺和不同的结晶条件下会形成不同的晶型，即不同固态形式[2-3]。越来越多的研究表明，不同晶型会赋予原料药不同的理化性质，也会从各方面影响最终制剂的表现，如晶型转变、粉末流动性、溶出曲线、药物稳定性和与辅料的相互作用[4-7]。国内罗红霉素原料供应厂家众多，生产工艺各异，虽然化合物都达到了要求的化学标准，但是因为没有统一的物态标准，晶型、粒度等难以统一。因此，在没有对固体原料全面表征，尤其是与原研药品使用的原料进行比较研究的情况下，任意使用1种市售原料药开展仿制药开发，实现同原研药同质、同效的目标是难以得到保障的[8-10]。这是市售的各个厂家制剂产品药物溶出和药效与原研药品差异显著的一个主要原因。
目前，国内正在开展仿制药一致性评价工作，就意味着对仿制药品质量和疗效的要求明确统一[11]。原料药在很大程度上决定了制剂终产品的质量特性，尽管也可以通过其他手段来改善制剂的质量特性和制剂工艺的可靠性，但是这些手段往往都不如直接控制原料药的特性有效。因此实施处方前研究，可为处方工艺提供全面的设计依据[12-14]。为了达到与原研药品一致，要求原料药供应商对产品质量持续提高和标准透明，使制剂仿制企业能在制剂处方、制备工艺等技术壁垒问题上分配更多资源，药物最终能够稳定、有效，并达到工业化生产中制剂处方和制剂工艺的要求，有利于提升我国的制剂生产水平[15]。本研究使用市售5种不同厂家生产的罗红霉素原料药，开展了晶型表征，研究其理化性质、稳定性、溶解曲线，并以同一处方压制成片剂，考察溶出行为，揭示了仿制药品的处方前研究（pre-formulation study）尤其是全面深入的原料药和辅料对比研究，对最终产品与原研药品的质量和体内生物等效性一致的重大意义。
1 仪器与试药Empyrean DY01610 X射线粉末衍射仪[PANalytical（帕纳科）公司]；JSM-6510 A扫描电镜（捷欧路科贸有限公司）；DTG-60H差热-热重同步分析仪（岛津公司）；SHH-250 SD药品稳定性试验箱（重庆永生实验仪器厂）；GHP-9050隔水式培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；1580R多用途高速离心机（基因有限公司）；DP 30 A单冲压片机（北京新龙立科技有限公司）；DHG-9140电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HE83水分测定仪（梅特勒-托利多仪器公司）；智能溶出试验仪（天津天大天发科技有限公司）；1200安捷伦高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；ZORBAX OSD色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm，安捷伦公司）。
罗力得[赛诺菲-安万特（Sanofi-Aventis）公司]；罗红霉素原料药RM-1（A制药有限公司）；罗红霉素原料药RM-2（B药业有限公司）；罗红霉素原料药RM-3（C制药有限公司）；罗红霉素原料药RM-4（D药业有限责任公司）；罗红霉素原料药RM-5（E药业有限公司）；玉米淀粉、低取代羟丙基纤维素（L-HPC）、聚维酮K30、滑石粉、硬脂酸镁、轻质无水二氧化硅、泊洛沙姆；乙腈为色谱纯，三乙胺、磷酸二氢铵、磷酸均为分析纯，实验用水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 5种罗红霉素原料药XRPD分析试验条件：X射线源为Cu靶，管压40 kV，管流40 mA，2θ扫描范围4°~40°，扫描速度8 °·min-1，步长0.02°，发射狭缝DS=1°，接收狭缝RS=0.15 mm，散射狭缝SS=1°。取5种罗红霉素原料药粉末进行测试。试验结果如图 1所示，不同原料药的晶型之间存在差异。RM-1与RM-4在2θ（6.28°、9.88°、10.42°、11.74°、12.62°、14.64°）或附近有衍射特征峰，而RM-2、RM-3和RM-5则是在2θ（8.46°、9.92°、11.80°、13.36°、14.38°）或附近出现衍射特征峰。从表 1数据可知，RM-1与RM-4的峰位相近，RM-2、RM-3与RM-5的峰位相近。因此，由5种粉末衍射的特征峰结果，揭示市售罗红霉素原料药存在多晶型现象，根据晶型峰位将这些原料药分为A类（RM-1、RM-4）和B类（RM-2、RM-3、RM-5）。
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图 1 罗红霉素原料药的X射线粉末衍射图谱 Fig.1 XPRD spectra of roxithromycin APIs |
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表 1 罗红霉素原料药的XRPD衍射特征峰及强度 Tab.1 Bragg positions and intensity ratios(I/I0)for XRPD characteristic peaks of roxithromycin APIs |
分别取5种罗红霉素原料药，采用JSM-6510A扫描电子显微镜观察原料药的表观状态。
试验结果如图 2所示，SEM分析表征显示5种罗红霉素原料药的表面状态存在差异。A类（RM-1、RM-4）晶体表面有较多小的晶粒吸附在上，说明颗粒之间的粘附力较强；B类（RM-2、RM-3、RM-5）晶体表面较为平滑，平滑的表面上存在褶皱，结晶不完好的地方存在分层现象。粒子大小顺序为B类晶型 > A类晶型。
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图 2 罗红霉素原料药的SEM表征 Fig.2 SEM micrographs depicting the morphology of roxithromycin APIs |
试验条件：采用铝坩埚，升温区间25~250 ℃，氮气流速50 mL·min-1，升温速率为10 ℃·min-1。
试验结果表明，5种原料药的熔融顶峰温度和吸热焓存在差异。其中A类（RM-1、RM-4）的温度较低，为123.07、122.78 ℃，熔融所吸收的热量也较少，吸热焓分别为-352.59、-318.25 J·g-1；B类（RM-2、RM-3和RM-5）的熔融顶峰温度较A类大，分别为125.76、124.43和124.66 ℃，吸热焓明显高于A类，分别为-425.55、-438.24和-373.97 J·g-1。试验结果说明，在相同热力学条件下，相对于A类（RM-1和，RM-4），B类（RM-2、RM-3和RM-5）呈现较高的稳定性，因此命名B类为稳定晶型，A类为亚稳定晶型。
2.4 罗红霉素原料药溶解速率试验试验条件：称取5种罗红霉素原料药各100 mg到锥形瓶中，加入去离子水10 mL，于恒温摇床中震摇，按不同的间隔时间5、10、15、20、30、45、60、90、120、180、240、480、660 min，将锥形瓶取出，取液过滤，吸取滤液2 mL，以去离子水滴定稀释5倍，0.45 μm滤膜过滤，取滤液进行HPLC法测定含量。色谱条件：采用Agilent ZORBAX OSD色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），以0.067 mol·L-1磷酸二氢铵溶液（用三乙胺调节pH至6.2）-乙腈（60:40）为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长210 nm，柱温30 ℃，进样量为20 μL。
试验结果如图 3所示，罗红霉素2类晶型在水介质中表现出不同的溶解速率。A类（RM-1和RM-4）亚稳定形式的晶型在溶解初期，由于含较大的内能，溶解速度较B类（RM-2、RM-3、RM-5）稳定态晶型明显的快。但是A类晶型的溶解速度达到高峰值后陡然降低，随着时间延长趋于稳中有降势态。溶解曲线说明亚稳定晶型在过饱和溶液中的溶解速率测定表现比较复杂，其在溶解过程中可能同时经历着晶型的转变，导致溶解度下降，药物结晶析出。
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图 3 罗红霉素原料药在37 ℃去离子水中溶解曲线 Fig.3 Solubility curves of roxithromycin APIs in deionized water at 37 ℃ |
B类（RM-2、RM-3和RM-5）稳定态晶型的溶解趋势稳定，曲线平滑，不存在拐点。这更进一步证明了B类晶型为稳定态晶型。在能够保证药物体外溶出和体内吸收的前提下，制剂应选择稳定的原料药晶型用于生产，以保证制剂质量的稳定性。
2.5 稳定性试验 2.5.1 高温试验将5种罗红霉素原料药的样品敞口放置于洁净培养皿中，60 ℃稳定箱下放置10 d，于第10天取样，应用XRPD对样品进行分析。
试验结果如图 4所示，5种原料药的特征峰并未发生明显变化，说明在高温条件下放置10 d，2类晶型都能稳定存在。
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图 4 罗红霉素原料药在60 ℃下放置10 d的XRPD图谱 Fig.4 XRPD patterns of roxithromycin APIs after storage at 60 ℃ for 10 days |
将5种罗红霉素原料药的样品敞口放置在洁净培养皿中，90% RH稳定箱下放置10 d，于第10天取样，应用XRPD对样品进行分析。
试验结果如图 5所示，5种原料药的衍射特征峰在高湿环境下晶型均未发生变化，说明在高湿条件下放置10 d，2类晶型都能稳定存在。
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图 5 罗红霉素原料药在90%RH下放置10 d的XRPD图谱 Fig.5 XRPD patterns of roxithromycin APIs after storage at 90%RH for 10 days |
将5种不同厂家生产的罗红霉素原料药，在60 ℃和90% RH 2种条件下敞口放置，第10天取原料药适量，配成已知浓度溶液，HPLC法测定其含量。
试验结果见表 2，第10天时，5种原料药的含量（n=3）没有发生变化。并且在高湿、高温条件下含量稳定，无降解现象。
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表 2 罗红霉素原料药稳定性考察（n=3） Tab.2 Drug contents of roxithromycin APIs on stability study |
称取罗红霉素原料药粉末约2 g于锥形瓶中，加入100 mL去离子水作为介质，于25 ℃，75 r·min-1的恒温摇床中放置4 h，使粉末和水分充分接触。所得溶液4 000 r·min-1离心10 min，烘箱干燥12 h，获得粉末进行XRPD检测。
试验结果见图 6，在粉末颗粒充分与水分接触后，A类晶型（RM-1，RM-4）原本在6.28 °处的特征峰消失，转变成在8.36 °出现峰。而B类（RM-2、RM-3和RM-5）经过在水中4 h的处理，峰位没有明显改变，说明该晶型在水中稳定。本次试验结果进一步证明A类为罗红霉素的亚稳定形式，并且在适当条件下，A类晶型会向B类稳定形式转变。因此由A类晶型制成的固体制剂存在质量不稳定和药效不稳定的可能性。
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图 6 罗红霉素原料药暴露于水中4 h的XPRD谱图 Fig.6 XRPD patterns of roxithromycin APIs after exposure to water for a period of 4 h |
按照2015年版《中华人民共和国药典》关于罗红霉素片溶出度要求，以醋酸盐缓冲液（pH 5.5）（取0.04 mol·L-1醋酸钠溶液，用冰醋酸调节pH至5.5）900 mL作为体外溶出介质。
2.6.2 色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX OSD（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相：0.067 mol·L-1磷酸二氢铵溶液（用三乙胺调节pH至6.2）-乙腈（65:35）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃; 进样量：20 μL。
2.6.3 罗红霉素片剂在溶出介质中的溶出度测定以醋酸盐缓冲液（pH 5.5）900 mL作为溶出的介质，桨法转速为50 r·min-1或65 r·min-1，温度为（37±0.5）℃，分别在5、15、30、45、60、90 min时，取样10 mL，经0.22 μm微孔滤膜滤过，按“2.6.2”项下色谱条件进样分析，测定罗红霉素的含量。
2.6.4 罗红霉素片制备通过查阅罗红霉素片参比制剂说明书以及制剂制备预试验结果[16]，初步确定罗红霉素片剂的辅料组成和用量。
处方：罗红霉素（70%）、玉米淀粉（17.25%）、低取代羟丙基纤维素（5%）、聚维酮K 30（4%）、滑石粉（2%）、硬脂酸镁（0.75%）、轻质无水二氧化硅（0.5%）、泊洛沙姆（0.5%）。
制备工艺：（1）将罗红霉素原料药过80目筛，称取处方量的原料药、玉米淀粉、L-HPC、滑石粉物理混合均匀；（2）配制浓度为4%的聚维酮K 30溶液，作为黏合剂，备用；（3）将制备好的黏合剂溶液加入到（1）的混合物中，制成湿软材，软材过18目筛制粒；（4）制得湿颗粒在60 ℃烘箱干燥，检查水分低于2%后，过18目筛整粒；（5）依次加入0.5%轻质无水二氧化硅和0.75%硬脂酸镁，均匀混合；（6）将总混合物料放置到单冲压片机上进行压片，冲模为6.5 mm浅凹圆形冲头，理论片重为每片110 mg。按照此法将A、B 2类晶型对应的原料药压制成片剂。
2.6.5 罗红霉素标准溶液配制精密称定罗红霉素对照品适量8 mg，用上述溶出介质溶解并稀释制成每1 mL含0.08 mg的溶液，以0.45 um滤膜过滤，即得对照品溶液。按“2.6.2”项下条件进样测定含量。按外标法以峰面积计算出每片的溶出量，限度为标示量的80%应符合规定。
2.6.6 溶出曲线测定及不同转速对比取2种晶型的罗红霉素自制片，按照上述方法测定，在5、15、30、45、90 min时，分别取溶液10 mL，0.22 μm微孔滤膜滤过，并及时在溶出杯中补充等温溶出介质10 mL，续滤液作为供试溶液进行含量测定，计算每片在不同时间的溶出量（n=6）。
以50 r·min-1作为溶出转速，在5、15、30、45、90 min时取样进行测定。结果（图 7）表明，在50r·min-1低转速下，2种片剂的溶出差异明显，A类晶型的罗红霉素片溶出较B类晶型溶出慢。A类晶型压片后片剂粘度较大，在介质中崩解缓慢，足够长时间后，不再继续崩解溶出。而B类晶型，压片后片剂粘度适中，溶出过程崩解较快。90 min时A类晶型片剂与B类晶型片剂的溶出度分别为72.34%和78.38%。由于最终溶出量偏低，由此推测50 r·min-1转速过低，片剂沉在溶出杯底部未被搅匀，也由此发现A类晶型粉末制得的片剂的崩解行为与B类晶型的有差异，故调整桨转速再验证。
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图 7 A、B类晶型压片后对应片剂溶出曲线（50 r·min-1） Fig.7 Dissolution profiles of tablets of crystal type A and B |
以65 r·min-1作为溶出转速，在5、10、15、20、30、45 min时取样进样测定。结果（图 8）表明，在65r·min-1适当转速下，2种片剂的溶出曲线可以区分开，差异在前10 min时间段尤为明显。A类晶型的罗红霉素片溶出度较B类晶型慢，这可能是因为A类晶粒之间粘附力较大，制粒后粉末颗粒流动性较差，压片后片剂较为紧实，导致溶出时崩解较慢。在足够长时间后，2种晶型制得制剂溶出度A类为78.55%，B类为80.29%。
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图 8 A、B类压片后对应片剂溶出曲线（65 r·min-1） Fig.8 Dissolution profiles of tablets of crystal type A and B |
试验条件同“2.1”项。取2类晶型对应片剂、原研罗力得片剂和本处方纯辅料进行研磨后，测定。
试验结果见图 9，A、B 2类晶型原料药经压片后均未发生晶型改变，因此推测晶型差异的影响能延续到溶出曲线的检查。如图 9所示，B类晶型片剂与原研片剂在2θ 8.56°、9.98°、10.56°、11.16°、11.84°、13.44°或附近出现衍射特征峰，而A类晶型片剂则在2θ 6.45°、8.52°、10.02.°、10.48°、11.2°、11.86°出现衍射特征峰。由数据可知，辅料和制剂过程对原料药晶型干扰较少，B类晶型片剂压片后粉末与原研片粉末的峰位相近，与A类晶型片剂有明显差别。因此，在保持与原研药品所用原料药物态一致的前提下，应优先选择B类晶型原料药用于制剂研发，以确保溶出曲线的一致。
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图 9 2类罗红霉素片剂、原研药罗力得和纯辅料XPRP图谱 Fig.9 XRPD patterns of two-type crystal form tablets, blank excipients and Rulide |
药物多晶型现象是影响药品质量与疗效的重要因素之一，一般药物晶型的研究对水中难溶性的口服固体药物更具意义，这对在处方开发早期降低风险十分重要。药物表面自由能差异所造成结晶颗粒之间的粘附力不同，会影响制剂颗粒的流动性、片剂的崩解速度和制剂的稳定性。现代药品开发的趋势是把控制点前移，制剂质量问题的调整和解决应该首先考虑原料药的性质，其次是辅料包材的相容性，再次考虑制剂的处方工艺。
原研药品的溶出来源于临床试验，即测定溶出度的方法和限度是根据临床而不是药学确定的，一般情况下原研药品已经根据临床作用的效果做了晶型的筛选。直接检查原研制剂的晶型只在部分载药量较高的情况下才可行，且要确定辅料没有干扰，即使可靠性有限，但也可以作为制剂前研究的参考。药物终制剂的所有表观结果都是各方面微观原因的综合体现，实质不研究清楚，就无法获得可靠、可重复、质量一致的结果。溶出曲线一致，也会有助于提高生物等效性的成功率。
本研究通过使用XRPD、SEM、DTG、粉末溶解速率等手段，对市售的5个厂家生产的罗红霉素原料药进行晶体形态和理化性质表征，揭示了其存在稳定（B类）和亚稳定（A类）2类晶型。考察溶解速率发现2类晶型粉末在水中的溶解曲线显著不同。初步制片剂考察溶出曲线，观察到了2类晶型片剂溶出曲线的明显差别。考察片剂溶出曲线，观察到了2类晶型片剂溶出曲线的不可重合现象。同时，2类晶型原料药自制片与原研片研磨后的粉末，经XRPD比对发现B类晶型与原研药品所用晶型更为相近。就上述研究结果来看，不同厂家生产的罗红霉素原料药的晶型状态确实存在差异，但其是否会对最终制剂质量产生影响有待于进一步研究。
| [1] |
王建, 曾红霞, 洪利娅. 罗红霉素在胃肠道介质中溶解度、油水分配系数、稳定性及原研片溶出行为研究[J]. 药物分析杂志, 2013, 33(10): 1787. WANG J, ZENG HX, HONG LY. Solubility, oil/water partition coefficient and stability of roxithromycin in gastrointestinal medium, and the dissolution behavior of original tablets[J]. Chin J Pharm Anal, 2013, 33(10): 1787. |
| [2] |
胡欣, 金鹏飞. 仿制药和专利药临床疗效差异的技术思考[J]. 中国新药杂志, 2012, 21(6): 601. HU X, JIN PF. Technical discussion on the curative effect differences between generic drugs and propertietary drugs[J]. Chin J New Drugs, 2012, 21(6): 601. |
| [3] |
赖安平, 吴朝刚, 关键, 等. 研究化学原料药生产中的结晶问题[J]. 化工管理, 2016, 423(26): 68. LAI AP, WU CG, GUAN J, et al. Study on crystallization in the production of chemical ingredients[J]. Chem Enterprise Manage, 2016, 423(26): 68. DOI:10.3969/j.issn.1008-4800.2016.26.051 |
| [4] |
付莉娜, 郑金琪, 陶巧凤. 不同晶型替米沙坦对制剂溶出行为的影响[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(8): 1137. FU LN, ZHENG JQ, TAO QF. Effect of different crystal type of telmisartan on the dissolution behavior of preparation[J]. Chin J Mod Appl Pharm, 2017, 34(8): 1137. |
| [5] |
张娜, 赵赢, 杨世颖, 等. 不同来源普伐他汀钠原料药的晶型研究[J]. 药物分析杂志, 2016, 36(12): 2139. ZHANG N, ZHAO Y, YANG SY, et al. Study on crystallogragpic form of crystalline materials of pravastatin sodium from different sources[J]. Chin J Pharm Anal, 2016, 36(12): 2139. |
| [6] |
王建, 曾红霞, 陈悦. 罗红霉素晶型分析及与溶解速率、溶出度的关系[J]. 中国现代应用药学, 2013, 30(10): 1094. WANG J, ZENG HX, CHEN Y. Relationship of roxithromycin crystal types, dissolution rates and dissolution[J]. Chin J Mod Appl Pharm, 2013, 30(10): 1094. |
| [7] |
张涛, 赵先英. 药物研究和生产过程中的多晶型现象[J]. 中国新药与临床杂志, 2003, 22(10): 615. ZHANG T, ZHAO XY. Polymorphism during study on drugs and production[J]. Chin J New Drugs Clin Rem, 2003, 22(10): 615. DOI:10.3969/j.issn.1007-7669.2003.10.011 |
| [8] |
陈桂良, 李君婵, 彭兴盛, 等. 药物晶型及其质量控制[J]. 药物分析杂志, 2012, 32(8): 1503. CHEN GL, LI JC, PENG XS, et al. Drug polymorphism and related quality control[J]. Chin J Pharm Anal, 2012, 32(8): 1503. |
| [9] |
薛晶, 许鸣镝, 南楠, 等. 原辅料及制剂处方工艺对口服固体制剂溶出行为的影响[J]. 中国新药杂志, 2017, 26(12): 1370. XUE J, XU MD, NAN N, et al. Effect of APIs, excipients, formulation and technologies on the dissolution profile of solid oral preparation[J]. Chin J New Drugs, 2017, 26(12): 1370. |
| [10] |
BIRADAR SV, PATIL AR, SUDARSAN GV, et al. A comparative study of approaches used to improve solubility of roxithromycin[J]. Powder Technol, 2006, 169(1): 22. DOI:10.1016/j.powtec.2006.07.016 |
| [11] |
杜冠华, 吕扬. 仿制药一致性评价相关药物晶型的问题分析[J]. 医药导报, 2017, 36(6): 593. DU GH, LÜ Y. Discussion on polymorphs in the consistency assessment of generic drugs[J]. Her Med, 2017, 36(6): 593. |
| [12] |
吕扬, 张丽, 杨世颖, 等. 多晶型药品的质量控制技术与方法应用要求[J]. 中国新药杂志, 2014, 23(7): 759. LÜ Y, ZHANG L, YANG SY, et al. Requirements of technologies and methods for quality control of drug polymorphism[J]. Chin J New Drugs, 2014, 23(7): 759. |
| [13] |
王蕾, 刘德胜, 潘宁, 等. 药物多晶型与固体制剂的关系研究进展[J]. 辽宁药物与临床, 2001, 4(1): 35. WANG L, LIU DS, PAN N, et al. Research progress on the relationship between drug polymorphism and solid preparation[J]. Liaoning Drugs Clin Rem, 2001, 4(1): 35. DOI:10.3969/j.issn.1673-0070.2001.01.023 |
| [14] |
郝甜媛, 刘欢, 陈常青. 晶型转化对药物稳定性的影响研究进展[J]. 现代药物与临床, 2013, 28(3): 457. HAO TY, LIU H, CHEN CQ. Advances in study on influence of crystal transformation on drug stability[J]. Drugs Clin, 2013, 28(3): 457. |
| [15] |
AUCAMP M, STIEGER N, BARNARD N, et al. Solution-mediated phase transformation of different roxithromycin solid-state forms:implications on dissolution and solubility[J]. Intl J Pharm, 2013, 449(1-2): 18. DOI:10.1016/j.ijpharm.2013.03.048 |
| [16] |
吉顺莉, 倪华, 何磊. 罗红霉素片的制备及溶出度考察[J]. 中国抗生素杂志, 2017, 42(9): 802. JI SL, NI H, HE L. Preparation and in vitro dissolution evaluation of roxithromycin tablets[J]. Chin J Antibiot, 2017, 42(9): 802. DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2017.09.017 |