头孢曲松钠(ceftriaxone sodium,CS)是第3代头孢类抗生素,具有抗菌谱广,半衰期长和组织穿透力强等特点,在临床上被广泛应用[1-2]。头孢曲松钠固体粉末有3种亚晶型[3-5]和2种结构对映体[6],使得仿制药在临床上的效果与原研药物罗氏芬(Rocephin)相比存在较明显差异[4, 7-9]。
抗生素微生物检定法是直接评价抗生素体外生物活性的方法之一。其常用分析方法有管碟法、浊度法、化学发光法和免疫分析法等,其中前2种方法被《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)收载[10],也被世界主要国家和地区的药典收载及使用。随着药物精制工艺的不断进步,许多抗生素药物的效价评价被高效液相色谱法(HPLC法)取代。但是,HPLC法仅能从化学性质上分析抗生素的纯度,并不能反映抗生素对微生物的真实抑菌效果[11],采用《中国药典》2015年版头孢曲松钠各论规定的其他项目也不能反映生物活性差异。然而,传统的效价测定方法存在操作复杂,影响因素多,受药物溶解性和扩散率影响大等问题[12]。
等温微量热技术(isothermal microcalorimetry,IMC)是一种实时监测体系中能量变化的技术,可以指征微生物生长繁殖的活跃度[13-16]。在微生物的对数生长期中,微生物的能量(P)与时间(t)存在数学关系:ln Pt=lnP0+kt。其中,P0和Pt分别是微生物在对数生长初始点t0和生长t时的热功率,k为微生物生长速率常数[17]。IMC技术具有测试快,准确度好及实时监测等优点,已广泛应用于抗菌活性物质筛选[18-19]、最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)测定[20-21]以及微生物鉴定[22]等领域。
本研究将MIC测定技术应用于抗生素体外微生物抑菌活性测试中,以微生物热谱图曲线拟合和参数分析为基础,研究用于快速测定抗生素的体外微生物抑菌活性的热动力学方法及评价指标,比较和分析头孢曲松钠测试药品与原研药品在体外微生物活性上的差异。
1 实验材料测试菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)采购自美国模式菌种保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。挑取一接种环菌株培养物至10 mL脑心浸液培养基(brain heart infusion,BHI)中,于(36±1)℃新鲜培养(24±1)h,及时使用。效价测定用pH 6.0磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)和Ⅲ号培养基按《中国药典》2015年版四部(通则1201)制备。实验所用培养基采购自北京陆桥技术有限责任公司。如可能,用于微量热试验的器具均采用121 ℃持续15 min的方式处理。
头孢曲松钠原研药采用罗氏药业生产的罗氏芬(批号SI15040165),头孢曲松钠对照品采购自中国食品药品检定研究院(批号130480-201504),测试的仿制药由上海新先锋药业有限公司提供(代号MY)。
实验所用主要设备为TAM Ⅳ型微量热仪(TA仪器,美国)、DXR拉曼光谱仪(Thermo Fisher,美国)和X射线衍射仪XRD 6000(岛津,日本)。
2 实验方法 2.1 微生物起始浓度的确定取Ⅲ号培养基5 mL,加入新鲜培养的金黄色葡萄球菌培养物5 μL,用Ⅲ号培养基按10倍浓度梯度依次稀释(菌液浓度范围101~105 CFU·mL-1)。分别取稀释液2 mL,放入已预平衡的微量热仪中。以Ⅲ号培养基2 mL为空白对照,按仪器操作说明书测量、收集不少于22 h的数据。用胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)平板计数法,参照《中国药典》2015年版非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法(通则1105),对加入到Ⅲ号培养基中的金黄色葡萄球菌进行计数。重复3次实验。
根据热谱图的形状和热动力曲线,选择适宜的菌液浓度,并筛选热谱图参数。
2.2 药物测量质量浓度(Cn)的确定精确称取罗氏芬粉末50 mg,加入PBS溶液5 mL,充分混匀,制成储备液。取一定量储备液加入到Ⅲ号培养基5 mL中,充分混匀,并依次按比例梯度稀释,制备不同Cn的测试液(Cn分别为0.25、0.40、0.46、0.50、0.56、0.60、0.66、0.70、0.76、0.80、1.00、2.00和4.00 mg·mL-1)。分别向各Cn的测试液中加入新鲜培养的金黄色葡萄球菌培养物,使得菌液终浓度在本文“2.1”项确定的区间内。取上述含菌测试液2 mL置于微量热仪中检测。以含相同菌量的Ⅲ号培养基2 mL作为对照,并计数体系中金黄色葡萄球菌的数量。
通过分析热谱图中主要定量参数与药物浓度之间的数学关系,建立快速、简易、通用的微量热测试方法。
2.3 抗生素效价测定参考《Requirements for antibiotic products of Japan》(1993年)对头孢曲松钠管碟法测试的规定,以金黄色葡萄球菌ATCC 6538为测试菌株,pH 6.0 PBS溶液为药物溶剂,采用含1.5 %琼脂的Ⅲ号培养基,对目标药物进行效价测定。其他步骤按照《中国药典》2015年版抗生素微生物检定法(通则1200)二剂量法。
HPLC法含量测定按照《中国药典》2015年版二部头孢曲松钠各论中含量测定项下的色谱条件和方法测定。
2.4 药物的光谱扫描参照《中国药典》2015年版拉曼光谱法(通则0421)定性鉴别的要求,分析头孢曲松钠固体粉末拉曼光谱图。光源波长532 nm,激光强度10.0 mW,光谱扫描范围50~3 400 cm-1区间,扫描400次。
参照《中国药典》2015年版X射线衍射法(通则0451)第二法的要求,分析头孢曲松钠固体粉末晶型组成。以铜为靶材,电压40 kV,电流40 mA,发射狭缝1 m,散射狭缝1 mm,接受狭缝0.30 mm,采用连续扫描方式在3°~45°之间以0.02°为扫描步进角,3°·min-1的速度连续扫描。
2.5 微量热法测试抗生素体外活性采用上述微量热测试方法和参数分析方式,快速评价罗氏芬、样品MY和对照品3种不同来源的抗生素体外抑菌效果。
3 实验结果 3.1 微生物起始测试浓度通过对5组起始浓度为Nn(n=1~5)的金黄色葡萄球菌进行检测,N1~N5分别代表浓度约为101、102、103、104和105 CFU·mL-1的金黄色葡萄球菌培养物(图 1)。随着测试菌液浓度的增加,达到热谱图最高功率值(Pmax)的主峰出峰时间(tn)不断减少,图谱形状保持相对一致。金黄色葡萄球菌浓度的对数值(log10 Nn)与Δtn符合正相关线性关系,3次独立试验的线性回归系数R2均大于0.99(表 1)。其中,Δtn是第n组热谱图主峰出峰时间(tn)与N5组主峰出峰时间(t5)的差值(Δtn= tn-t5),如图 1中Δt4所示。将测试数据进行直线拟合(图 2),参数log10 Nn与Δtn之间仍有较为明显的直线关系(R2>0.96),拟合公式为Δtn=-120.04 log10Nn+662.55。
当头孢曲松钠溶液Cn大于2.00 mg·mL-1时,仪器检测不到微生物的生长热信号,金黄色葡萄球菌的生长被完全抑制(表 2)。当头孢曲松钠Cn在1.00~2.00 mg·mL-1时,热谱图的出峰时间(tn)随浓度提高快速增长至无穷大(图 3-A),此时,头孢曲松钠浓度达到MIC值。当头孢曲松钠Cn在0.25~0.80 mg·mL-1时,可在22 h内检测到热信号。
采用公式(1)和(2)分别计算Δtn的归一化值α和kn归一化值β。
$ \alpha = \frac{{\Delta {t_n}}}{{{{\log }_{10}}{N_0}}} $ | (1) |
$ \beta = \frac{{{k_n}}}{{{{\log }_{10}}{N_0}}} $ | (2) |
其中,Δtn是热谱图中第n条曲线主峰出峰时间(tn)与菌液对照组出峰时间(t0)的差值;kn是热谱图中第n条曲线的主峰左侧在近似直线区域拟合的斜率;N0为实验起始菌液浓度。头孢曲松钠Cn分别与α和β具备线性相关关系(图 3-B、C),线性回归系数R2分别为0.988和0.894。
选取头孢曲松钠Cn分别为1.00、0.60、0.50和0.25 mg·mL-14个点为代表(表 2),采用重现性条件获取测量数据,α的RSD分别为0.10%、7.07%、4.28%和1.18%,β的RSD分别为31.27%、17.47%、7.81%和12.50%。
3.3 抗生素效价测定结果采用HPLC法检测罗氏芬的含量测定值比样品MY的测定值高0.87%。为测试罗氏芬和样品MY对金黄色葡萄球菌的抑制作用,采用管碟法检测罗氏芬的效价比样品MY的效价高6.11%(表 3)。2种测试方法得到的结果有明显差异。
为分析罗氏芬与样品MY抑菌活性差异的原因,利用拉曼光谱和X射线粉末衍射技术对2种头孢曲松钠粉末进行测试。罗氏芬与样品MY在拉曼光谱扫描图谱结果中没有明显差异(结果未提供)。样品MY的X射线粉末衍射峰谱图与罗氏芬明显不同,样品MY可能由多种晶型或无定形成分组成,其晶型组成与罗氏芬存在差异(图 4)。
采用上述微量热法对2种头孢曲松钠进行测试,在参数α上,罗氏芬比样品MY高7.79%;在参数β上,罗氏芬比样品MY低8.28%(表 4)。从体外抑菌效果看,罗氏芬的抑菌能力明显高于MY。对照品的抑菌效果与MY相当,也低于罗氏芬。从重复性上看,测试中α的RSD均小于1.00%,β 的RSD均小于2.10%,方法重复性较好。
微量热技术测定的头孢曲松钠间效价的差异结果与采用管碟法测定结果一致。
4 讨论本研究利用微量热技术对头孢曲松钠的体外抑菌活性进行快速实时测定和分析。微量热技术与传统抗生素效价测定技术的相同之处在于,两者都是通过对细菌生长状态的检测反映抗生素对细菌的抑制效果,因此任何对微生物生长产生影响的步骤同样也会影响微量热的测定。但与传统技术不同,微量热技术除菌种活化和试剂配制需要人工操作外,后续步骤均封闭式全程自动监测和记录,过程控制精确(温控精度优于0.001 ℃),探测灵敏度极高(纳瓦级热量),可自动获取热谱图数据;而传统方法采用培养箱培养(温控精度最高为0.1 ℃),开关培养箱温差可超过5 ℃,易受环境变化影响,抑菌圈识别或浊度测定的分辨精度低,易受主观判断影响。由于微量热技术的检测灵敏度的提高,对操作人员试剂制备和菌液准备方面的要求更为严格,尤其是在称量、稀释和加样环节尽量准确。由于方法最终根据菌落计数结果引入了标准化的参数,因此,微量热技术对菌落计数结果的准确性要求高于传统效价测定法。
本实验中,微量热技术在重现性条件下多数测试点α的重现性指标可以满足小于5%的条件,在重复性条件下α的RSD均小于1.00%,也符合效价测定的要求。而β参数的重现性和重复性指标不太理想(RSD>5%)。而实验中管碟法的重现性RSD均小于1.00%。因此,采用α参数作为评价样品的指标要优于β参数,与管碟法效价实验的结果相当。实验中,单次试验数据的线性回归结果R2>99.5%,多次试验平行试验数据的R2下降到89.4%。上述数据显示,微量热技术重现性误差大于方法重复性误差。本次测试采用的是6通道检测设备,在实际测试中可将通道扩展至48个通道,扩大测试样品的通量,采用多次重复试验,消除样品操作过程引入的误差,也可实现多批次样品检测。
检测的时间与热谱图主峰出峰时间相关,随着起始微生物浓度的提高,热谱图出峰时间会缩短(图 1)。实验中选用的起始菌液浓度约为104 CFU·mL-1,在选定的药物浓度检测范围中,可在15 h内出现完整的热谱曲线主峰。本实验选用较低菌液初始浓度是为了使热谱图初始基线更平稳,有利于热力学参数的选择和评价。实际测试中可以增加微生物浓度至106 CFU或更高,使主峰出峰时间缩短至4 h以内[23-24]。这种调整不影响实验中α和β 2个参数的相对数量关系,并快速获得测试结果。
微量热技术可用于辅助测算抗生素的MIC值[17, 25]。采用本研究中头孢曲松钠浓度与参数β之间的线性关系(图 3-C),在系列浓度稀释的抗生素热谱图中,当β=0时,微生物的生长被完全抑制,即拟合直线与横坐标轴的交点可推断为测试抗生素的MIC值。其测试原理与美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐肉汤稀释法相同。但CLSI法采用2倍稀释梯度,以肉眼观察结果,存在较大的浓度间隔误差。微量热法无需特别考虑稀释的倍数关系,只需在线性范围内设计一系列浓度组合,即可拟合计算。本测试按标准曲线计算的MIC为1.30 mg·mL-1。
微量热法是对微生物与药物的混合物进行整体测定,而检测体系内非微生物生长放热,如:药物自身的化学或物理变化产生的热量,会干扰微量热仪的测定结果。此外,由于微量热法需要检测微生物生长的热量,需要通过培养体系支持微生物的生长与繁殖。如被测物在培养体系中不溶或微溶,需要额外添加助溶剂或乳化剂提高溶解能力。
本文辅助采用X射线衍射技术发现罗氏芬和样品MY在晶型组成上存在明显差异。不同晶型会影响药物的稳定性和生物利用度,从而影响药物的临床效果,但2种药物抑菌活性的差异是否由晶型不同导致还有待研究。
本文研究了微量热技术在抗生素体外抑菌效果测定中的应用,该技术具有速度快,灵敏度高,精密度好的特点,可用于实时测定抗生素的体外抑菌活性,在快速测定抗生素效价方面具有较好的应用前景。
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