2019, Vol. 39 
2. 天津天士力集团研究院, 天津 300410
2. Research Academy, Tianjin Tasly Group, Tianjin 300410, China
近年来，随着中药现代化的推进和国家科技重大专项的实施，中药材市场不断扩大，中药的工业化生产呈现持续扩大的势头。与此同时，国家有关部门对中药材的检测标准也更趋严格，《中华人民共和国药典》2015年版新增了重金属和有害元素等物质的检测限度标准[1]。尽管如此，中药材的质量与安全问题仍然令人堪忧。药品重金属及有害元素测定一直以来被作为判定药物质量的重要指标之一。随着环境污染日益加剧，工业三废、城市生活垃圾、污泥的排放及含重金属及有害元素的农药化肥的不合理使用等，中药材中重金属及有害元素含量日益增高，品质降低，甚至危害人体健康[2]。源头管理是解决中药材质量问题的根本，质量控制是中药安全有效的基础和保障，因此建立检测中药材中重金属及有害元素的高效灵敏的分析方法迫在眉睫。
常见的重金属及有害元素检测方法主要有紫外分光光度法、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS法）、高效液相色谱法、原子荧光光度法、原子吸收光谱法等[3]。ICP-MS法是一种痕量分析技术，供试品溶液制备和进样操作简便，可在较宽的范围内同时检测多种元素，具有灵敏度高，质量扫描速度快，运行周期短，对所提供的离子信息干扰程度小等优点[4]。ICP-MS对于大多数元素的检测下限极低，几乎可以取代传统的元素分析技术，是目前公认的较为理想的无机元素分析手段，已被广泛应用于食品、环境介质等多种领域的无机元素检测，成为目前国内外具有优势的检测和分析手段。近几年来，其广泛应用于各种药品的无机元素以及金属元素和有害元素检测，成为ICP-MS未来发展的趋势。
测量不确定度是定量分析结果的重要组成部分，是对所得数据真实性、客观性的科学评价[5]。以测量不确定度来评价中药质量是必然趋势，这符合国际要求，有利于中药分析水平的提高，促进中药的标准化、国际化发展[6]。测量不确定度是一个与测量结果相关联的参数，可以定量地说明测量结果的质量，测量结果的可靠性很大程度上取决于不确定度大小[7]。
消渴清颗粒（国药准字Z20080034）由苍术、蒲黄、知母、黄连和地锦草5种原料药材组成，用于治疗2型糖尿病。本文建立了ICP-MS法检测消渴清颗粒原料药材中15种重金属及有害元素的含量测定方法，并对检测过程中产生的不确定度进行了评估。本方法的建立，不仅为消渴清颗粒质量研究提供数据，也将为解决中药材的质量控制提供有价值的科学依据。
1 仪器与试剂 1.1 样品消渴清颗粒原料药材，包括苍术（北苍术Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根茎，批号20141201和20140402）、黄连（黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎，批号20140301）、蒲黄（水烛香蒲Typha angustifolia L.的干燥花粉，批号20140401）、知母（知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎，批号20140102）和地锦草（地锦Euphorbia humifusa Willd.的的干燥全草，批号20140402），由天士力医药集团股份有限公司提供。
1.2 试剂硝酸（优级纯，Z0353941532，Merck公司）；V、Cr、Ni、Cu、As、Mo、Ru、Rh、Pd、Cd、Ir、Pt、Au、Hg、Pb单元素标准溶液（1 000 mg·L-1，国家标准物质中心）；混合内标溶液（含6Li、45Sc、73Ge、89Y、115In、159Tb、209Bi元素，1 000 mg·L-1，CL1-46MKBY，国家标准物质中心）；超纯水（电阻率18.2 mΩ·cm-1）。
1.3 仪器ICAP-Q电感耦合等离子体质谱仪（Thermo Fisher公司）；MARS微波消解系统（Milestone公司）；Milli-Q纯水处理系统（Millipore公司）；Sartorius BP210S电子分析天平（Mettler Toledo公司）。
2 试验方法和数学模型 2.1 微波消解条件消解程序为10 min内由室温爬坡至180 ℃，再恒温消解15 min。功率由仪器自动调节。
2.2 ICP-MS仪器条件功率：1.55 kW；冷却气体积流量（氩气）：15.00 L·min-1；辅助气体积流量（氩气）：1.00 L·min-1；雾化气体积流量（氩气）：1.00 L·min-1；采样锥和截取锥：镍；采样深度：5.0 mm；重复次数：3；采用KED碰撞池模式；蠕动泵转速：24 r·min-1。
2.3 溶液的配制 2.3.1 标准工作储备溶液精密量取15种元素的单元素标准溶液适量，用5%硝酸分别稀释制成每1 mL含Ru、Rh、Pd、Cd、Ir、Pt、Au、Hg各5 μg，含V、Mo、Pb各25 μg，含Cr、As、Ni、Cu分别为100、100、200、500 μg的混合溶液。
2.3.2 系列标准工作溶液精密量取上述标准工作储备溶液适量，用5%硝酸稀释制成系列浓度混合溶液，即得。其中，Ru、Rh、Pd、Cd、Ir、Pt、Au、Hg系列质量浓度均为0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 ng·mL-1，V、Mo、Pb系列质量浓度均为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng·mL-1，Cr、As系列质量浓度均为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng·mL-1，Ni系列质量浓度为10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL-1，Cu系列质量为10.0、50.0、100.0、200.0、500.0 ng·mL-1。
2.3.3 内标工作溶液精密量取混合内标溶液（Li、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi）适量，用超纯水稀释制成20 ng·mL-1，即得。测定标准工作溶液及供试品溶液时，内标溶液由蠕动泵管在线加入。
2.3.4 供试品溶液及空白对照溶液取药材约0.2 g，精密称定，置于聚四氟乙烯（PTFE）消解罐中。加入65%硝酸5 mL，加盖密封，按“2.1”项条件进行消解。待消解完成后，消解液冷却至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，将消解液转至50 mL量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并于量瓶中，并用水定容、摇匀，即得。空白对照溶液如法处理。
2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察依次测定浓度由小至大的系列标准工作溶液，以测定元素与内标元素响应强度之比为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制得到标准曲线，求得回归方程。各元素的回归方程、相关系数及线性范围见表 1。结果表明，15种元素标准曲线的线性关系良好，相关系数均在0.992~1.000之间，能满足分析要求。
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表 1 回归方程、相关系数（r）、线性范围及检测下限 Tab.1 Regression equations, coefficient of correlation(r), linear ranges and detection limits |
取空白对照溶液10份，分别测定，以测定结果的3倍标准偏差（3SD）对应的元素质量浓度作为检测下限，见表 1。
2.4.3 重复性试验取批号为20141201的苍术药材样品0.2 g，精密称定，按“2.3.4”项方法制备供试品溶液，平行6份溶液，上机测定，并计算样品中待测元素的平均含量及其RSD。结果（表 2）所测元素的RSD均在5.0%以内，说明该方法具有良好的重复性。
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表 2 重复性试验结果 Tab.2 Result of repeatability test |
取批号为20141201的苍术样品9份，每份约0.2 g，平均分成3组。每组分别精密加入标准工作储备溶液50、100、200 μL，然后按“2.3.4”项方法进行消解，取出定容至50 mL，进行测定，并计算回收率及RSD。结果如表 3所示，各元素的回收率均在87%~115%之间，符合痕量分析要求。
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表 3 加样回收率试验结果 Tab.3 Results of the recovery |
样品中重金属及有害元素的含量可用下式进行计算：
| $ C_{\rm{X}}=\frac{C_{0} \times V}{M \times 1000} $ |
其中，CX为样品中待测元素的含量，μg·g-1；C0为标准曲线读取的元素的浓度，ng·mL-1；V为供试品溶液定容体积，mL；M为样品的称样量，g。
2.6 鱼刺图根据测定方法和数学模型，ICP-MS检测重金属及有害元素过程中的不确定度主要来源于5个方面：标准工作溶液的浓度、称取固体样品的质量、标准曲线拟合、样品前处理过程和测定过程中重现性所产生的不确定度[6]。可用鱼刺图来表述不确定度的各分量来源，见图 1。
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图 1 不确定度来源鱼刺图 Fig.1 An ishikawa (cause and effect) diagram for uncertainty of heavy metal elements by ICP-MS |
① 电子天平校准不确定度。由天平校准证书查得，万分之一天平允许误差为0.1 mg。按矩形分布，
| $ U_{\rm{rel}}(M)=\sqrt{(0.1 / \sqrt{3})^{2}+\left(\rm{SD}_{1} / \sqrt{10}\right)^{2} / 200} $ |
微波消解处理样品过程引入的不确定度评定常用回收率平均值的标准偏差来进行评估[10]。根据《JJF 1059.1—2012》4.3节可知，其计算公式为：
| $ {U_{{\rm{rel}}}}({R_1}) = \sqrt {\frac{{{{({R_{高}} - {R_{低}})}^2}}}{{12}}} $ |
其中，R高为加样回收率最大值，R低为加样回收率最小值，每个平行测定3次。
3.3 供试品溶液定容体积的不确定度供试品溶液定容过程的不确定度来源涉及3个方面[11]：①量瓶的校准。50 mL量瓶（A级）的允许偏差为±0.050 mL，按均匀分布（K=2）计算，
| $ U_{\rm{rel}}\left(v_{1}\right)=\sqrt{U\left(v_{\rm{1a}}\right)^{2}+U\left(v_{\rm{1b}}\right)^{2}+U\left(v_{\rm{1c}}\right)^{2} / 50} $ |
① 标准物质不确定度。由标准物质证书查得各元素的扩展不确定度Uk=0.7%。按正态分布，扩展因子k=2，标准物质引入的相对不确定度计算公式为Urel（b）=Uk/2。
② 标准工作溶液配制过程。标准工作溶液配制过程产生的不确定同“3.3”项的不确定度分析。公式为：
| $ U_{\rm{rel}}\left(v_{1}\right)=\sqrt{U_{\rm{rel}}\left(v_{2 \rm{a}}\right)^{2}+U_{\rm{rel}}\left(v_{2 \rm{b}}\right)^{2}+U_{\rm{rel}}\left(v_{2 c}\right)^{2}} $ |
其中，
| $ {U_{{\rm{rel}}}}\left( {{v_{2{\rm{a}}}}} \right) = \sqrt {{F_1}{U_{{\rm{rel5}}}}{{\left( {{v_{2{\rm{a}}}}} \right)}^2} + {F_2}{U_{{\rm{rel2}}}}{{\left( {{v_{2{\rm{a}}}}} \right)}^2} + {F_3}{U_{{\rm{rel1}}}}{{\left( {{v_{2{\rm{a}}}}} \right)}^2}} $ |
其中，F1、F2、F3分别为5 mL、2 mL、1 mL移液管在配制标准工作溶液过程中的使用次数。因此，由标准溶液引入的不确定度计算公式为：
| $ {U_{{\rm{rel}}}}(B) = \sqrt {{U_{{\rm{rel}}}}{{(b)}^2} + {U_{{\rm{rel}}}}{{\left( {{v_1}} \right)}^2}} 。$ |
采用内标法定量时，以待测溶液与内标溶液信号响应值之比R对待测元素浓度c进行校准曲线拟合。由校准曲线拟合引入的相对标准不确定度可按下式计算：
| $ {U_{{\rm{rel}}}}(C) = \frac{{{S_{\rm{R}}}}}{{b \times c}}\sqrt {\frac{1}{n} + \frac{1}{p} + \frac{{{{\left( {{c_0} - c} \right)}^2}}}{{\sum\limits_{j = 1}^n {{{\left( {{c_{0j}} - {c_0}} \right)}^2}} }}} $ |
式中，
重复对苍术样品（批号为20141201）进行6次平行测定，计算其平均含量H0及标准偏差。按照A类不确定度评定，计算公式为
以上各不确定度分量互不相关，因此样品中元素含量的合成标准相对不确定度计算公式为：
| $ {U_{{\rm{rel合成}}}}\;\;\;\;\; \text{=} \sqrt {{U_{{\rm{rel}}}}{{(M)}^2} + {U_{{\rm{rel}}}}{{\left( {{R_{\rm{l}}}} \right)}^2} + {U_{{\rm{rel}}}}{{\left( {{V_1}} \right)}^2} + {U_{{\rm{rel}}}}{{(B)}^2} + {U_{{\rm{rel}}}}{{(P)}^2} + {U_{{\rm{rel}}}}{{(C)}^2}} $ |
表 4为各元素不确定度计算结果。由测量不确定度评定可见，采用ICP-MS法测定药材中重金属及有害元素含量时，其测量不确定度主要来源于曲线拟合和微波消解过程，样品称量和定容引入的不确定度影响较小。同时也说明分析过程中每一步都存在着误差，且各种误差随着过程的进行而积累，构成了影响整个测量的不确定性[12]。
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表 4 各元素不确定度计算结果 Tab.4 Uncertainty of fifteen elements |
按本实验建立的方法，对5味药材中的15种金属元素及有害元素进行测定，结果见表 5。定量结果远远低于标准中的限度的要求。
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表 5 样品中各元素含量 Tab.5 Contents of the fifteen elements in samples |
消渴清颗粒具有药物稳定性高，口感好，携带方便等特性，配合抗糖尿病化学药品，用于Ⅱ型糖尿病属阴虚热盛挟血瘀证的治疗[13]。该剂型是由苍术、蒲黄、地锦草、黄连和知母5味药材组成的复方制剂。
5.2 实验方法的准确性分析样品测定结果的准确性在很大程度上依赖于选择正确的样品前处理方法。本实验采用微波消解法进行样品前处理，具有消解时间短，样品消化完全的优点[13-14]。实验选用内标法，一定程度上可减小仪器漂移误差和基体的干扰效应，提高了测量的准确率。实验建立的15种重金属及有害元素检测方法具有良好的线性关系，且重复性和精确度良好。线性系数均大于0.992，RSD低于5.0%，加样回收率在87%~115%之间。表明此方法准确、可靠，可用于药材中多种重金属及有害元素的测定。
5.3 不确定度分析本研究采用ICP-MS法测定消渴清颗粒药材中15种重金属及有害元素含量，根据实际计算可知，其测得的不确定度主要来源于曲线拟合和微波消解过程，而样品称量和定容引入的不确定度影响较小。因此曲线拟合以及微波消解是准确测定消渴清颗粒药材中重金属及有害元素的关键步骤。并且由计算公式可知，不确定度随溶液稀释的步骤增多而增大，因此在标准工作溶液配制中减少稀释步骤可以降低不确定度。除此之外，分析过程中每一步都存在着误差，且各种误差随着过程的进行而积累，构成了影响整个测量的不确定性。因此，通过选择合适、可行的实验方案，提高标准工作溶液配制过程的严谨度，富集样品中待测元素浓度，可有效减少不确定度，保证测量结果的准确性和可靠性，使得测定时更加接近真实值。
6 结论ICP-MS法测定的消渴清颗粒原材料药材中15种重金属及有害元素的不确定度主要来源于曲线拟合和微波消解过程，样品称量和定容引入的不确定度影响较小。检测实验室可以通过优化曲线拟合及微波消解过程的方法来降低ICP-MS法测定消渴清颗粒原材料药材中重金属及有害元素测定结果的不确定度。
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