2019, Vol. 39 
2. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
冬虫夏草（Cordyceps）是我国名贵的中药材，主要产自中国大陆青海、西藏、四川、云南、甘肃和贵州等省及自治区的高寒地带和雪山草原[1-2]，由于其资源稀缺，价格昂贵，受到广泛关注。近年来，由于受到自然因素和人为因素的影响，土壤重金属及有害元素污染情况越来越严重，由此成为中药材中重金属及有害元素污染的一个来源[3-6]，这与中药材对重金属及有害元素的吸收特性密切相关。在众多重金属及有害元素元素中，As是一类有毒的类金属元素，其在药材内以不同的形态价态相结合，毒性因不同的形态价态而不同[7-8]；此外，摄入Hg、Pb、Cd均会引起身体的损伤，例如Hg会引起肾功能损害，Pb会损害年龄较小的人群的神经系统，Cd损害人体中枢神经及骨骼[9-10]。近年来冬虫夏草中As污染情况逐渐受到广泛关注，有研究发现植物药材对As本身具有超强的富集作用[11-12]。本文在前期研究的基础上，采用电感耦合等离子体质谱法建立冬虫夏草产地土壤及药材中重金属及有害元素残留量的测定方法，对冬虫夏草产地土壤及药材中重金属及有害元素残留进行考察和评价，并分析了冬虫夏草中不同部位（子座和虫体）的重金属及有害元素污染情况，该研究对冬虫夏草中重金属及有害元素污染研究具有参考意义。
1 仪器与试药Agilent 7700电感耦合等离子质谱系统，配Babington雾化器；KQ-500E超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；Milli-Q超纯水处理系统；SHZ-B振荡仪（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；XS 105DU、FX-200电子天平（Mettler公司）；CEM MARS5微波消解仪（CEM公司）。
色谱级硝酸（Sigma公司），分析纯级氢氟酸（国药集团化学试剂有限公司）；Pb、Cd、As、Hg、Cu单元素标准溶液购于国家标准物质研究中心，其质量浓度均为100 μg·mL-1；调谐溶液为Li、Y、Ce、Tl、Co的混合标准溶液（Agilent公司，质量浓度为1 μg·L-1，批号5185-5959）；100 μg·mL-1的Li、Sc、Ge、Rh、In、Tb、Lu、Bi的混合内标溶液（Agilent公司，批号5188-6525）。
2 样品信息冬虫夏草样品采自西藏、青海、甘肃等地区，所有样品均经中国食品药品检定研究院标本馆康帅助理研究员鉴定为天然冬虫夏草；土壤样品采自冬虫夏草主要产地西藏、青海、甘肃等地，每个采样点按照系统随机法布点取样，采集后将土壤样品自然风干，剔除植物残体和石块，压碎，混匀，并用四分法取压碎样，过孔径1 mm尼龙筛，过筛后的样品充分搅拌混匀备用。
3 质谱条件等离子气流量：15.0 L·min-1；蠕动泵：0.20 r·s-1；雾化室温度：2 ℃；辅助气流量：0.8 L·min-1；He气流量：5 mL·min-1；载气流量：0.8 L·min-1；射频功率：1 550 W；数据采样模式：跳峰采集模式；采样深度：8 mm；重复次数：3次；扫描次数：100次。采样周期：0.1 s。
4 溶液的制备 4.1 内标溶液精密量取含72Ge、115In、209Bi的混合内标溶液适量，置100 mL量瓶中，用5%硝酸溶液（取70%硝酸溶液50 mL，用水稀释至1 000 mL）稀释至刻度（含72Ge、115In、209Bi各1 μg·mL-1），即得。
4.2 混合标准储备液精密量取Pb、Cd、As、Hg、Cu单元素标准溶液适量，用5%硝酸溶液稀释，制成每1 mL含Pb 0.5 μg，Cd 0.1 μg，As 0.5 μg，Hg 0.1 μg，Cu 5 μg的混合溶液，即得。
4.3 系列混合标准溶液分别精密量取混合标准储备液5.0、2.0、1.0 mL，各置50 mL量瓶中，加5%硝酸溶液稀释至刻度，得标准曲线第5点、第4点和第3点混合标准溶液；再分别精密量取标准曲线第5点混合标准溶液5.0、2.0 mL，各置100 mL量瓶中，加5%硝酸溶液稀释至刻度，得标准曲线第2点和第1点混合标准溶液。
4.4 供试品溶液将样品按“2”项下所述粉碎，精密称取粉末0.25 g，分别置微波消解罐中，加硝酸8 mL，按操作规程安装好装置，消解（3 min升温至120 ℃保持3 min，2 min升温至150 ℃保持3 min，2 min升温至200 ℃保持12 min），消解结束后，冷却至60 ℃以下，将消解罐置于100 ℃的加热板上，进行赶酸操作，赶至无棕黄色酸雾挥出，取出消解罐，放冷，将消解液转入至50 mL量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次（每次用水约5 mL），洗液合并至量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。同法同时制备试剂空白溶液。在处理土壤样品时，由于考虑到土壤中含有大量的硅酸盐成分，为便于消解完全，采用氢氟酸-硝酸（1:1）体系进行消解，其他条件不变，按照药材供试品溶液方法操作，即得土壤供试溶液。
5 测定方法测定时选取的同位素为63Cu、75As、114Cd、202Hg和208Pb，其中63Cu、75As以72Ge作为内标，114Cd以115In作为内标，202Hg、208Pb以209Bi作为内标，依次将样品管插入混合标准溶液、供试品溶液或土壤供试溶液中，内标管插入内标溶液中，按“3”项下质谱条件进行测定。
6 结果与分析 6.1 线性关系及加样回收率分别精密量取“4.3”项下系列混合标准溶液，按“5”项下方法进行测定。以计数比率为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，结果见表 1。
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表 1 线性关系和回收率 Tab.1 Linear relationship and recovery rate |
精密称取样品约0.25 g，加入硝酸8 mL，加入混合标准储备液1 mL，其他操作同“4.4”项下方法，制得供试溶液，按“5”项下方法进行测定，结果见表 1，各元素加样回收率均在80%~103%之间，符合痕量分析要求。
6.2 土壤重金属及有害元素含量考察及评价 6.2.1 土壤重金属及有害元素含量特征取8批采自冬虫夏草不同产地的土壤供试溶液，按“5”项下方法进行测定，按标准曲线法，通过仪器计算出浓度，再以稀释倍数和取样量计算Pb、Cd、As、Hg、Cu含量，结果见图 1所示。
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图 1 土壤中Pb、Cd、As、Hg、Cu测定结果（图中1~8为土壤样品编号；standard为标准规定限量，单位为mg·kg-1） Fig.1 Contents of Pb, Cd, As, Hg and Cu in soil[(1-8 in the figure is the soil sample number; standard is the standard limit, the unit is mg·kg-1)] |
按照《土壤环境质量标准》（GB15618-1995）一级标准，由测定结果可以看出，土壤中的Cd和As污染较为严重，不合格率分别为88%和50%，而Pb不合格率为25%，其他元素均合格，不合格统计见表 2。
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表 2 土壤中Pb、Cd、As、Hg和Cu不合格情况统计 Tab.2 Failure rates of Pb, Cd, As, Hg and Cu in soil |
采用合理的评价标准和方法有助于对土壤重金属及有害元素污染结果的科学性和有效性进行综合评价，本研究采用《土壤环境质量标准》（GB15618-1995）一级标准，对土壤单一重金属及有害元素评价采用单项污染指数法，对土壤整体重金属及有害元素评价采用内梅罗综合污染指数法[13-14]，根据污染指数P的变化划分为5个污染等级，见表 3。
单因子污染指数法通常是指能够分别反映目标物中各个元素的污染程度，其计算公式为Pi=Ci/Si（式中Pi为目标物中污染元素i的污染指数，Ci为污染元素i的实测浓度值，Si为i种污染元素的评价标准）。
土壤环境是一个复杂的体系，在实际情况考察中，由于目标物同时受到多种重金属及有害元素的污染，单项污染指数法不足以反应整体污染水平，所以需采用污染综合指数即内梅罗综合污染指数法进行评价来确定目标物的总体质量。内梅罗综合污染指数法兼顾单元素污染指数平均值和最大值，其计算公式为：
| $ P = \sqrt {\frac{{({{(\frac{1}{n}\sum\nolimits_{i = 1}^n {{P_{\rm{i}}}} )}^2} + {P_{{\rm{i}}(\max )}}^2)}}{2}} $ |
其中，P为目标物综合污染指数；Pi（max）为目标物中单项污染物的最大污染指数。
根据单项污染指数评价结果（表 4），冬虫夏草主要产地土壤Cu和Hg单项污染指数平均值分别为0.34和0.37，污染程度达到安全水平，Cd和As单项污染指数平均值分别为3.63和3.26，达到重污染水平，而Pb单项污染指数平均值为0.74，污染程度处于警戒线水平，综合来看冬虫夏草主要产地土壤的内梅罗综合污染指数为3.24，重金属及有害元素污染总体处于重度污染水平。总的来看，冬虫夏草主要产地土壤中5种重金属及有害元素平均单项污染指数由大至小顺序为Cd、As、Pb、Hg、Cu，其中Cd、As、Pb是主要的土壤污染物，而Hg和Cu则基本不存在污染情况。
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表 4 土壤中5种重金属及有害元素单项污染指数和内梅罗综合污染指数评价结果 Tab.4 Evaluation results of single factor pollution index and comprehensive pollution index for 5 heavy metals and harmful element in soil |
收集的5批次虫草Cu、Cd、Hg、Pb、As检测结果见表 5。
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表 5 冬虫夏草中Pb、Cd、As、Hg、Cu检测结果（mg·kg-1，n=2） Tab.5 Contents of Pb, Cd, As, Hg and Cu in Cordyceps |
按照现行2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）植物药重金属及有害元素的限量标准，5批次冬虫夏草中As元素不合格率为100%，其他元素均合格，不合格统计见表 6。
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表 6 冬虫夏草中Pb、Cd、As、Hg、Cu不合格率统计 Tab.6 Failure rates of Pb, Cd, As, Hg and Cu in Cordyceps |
另外将5批次天然冬虫夏草子座与虫体分开，进行Pb、Cd、As、Hg、Cu测定，其中检测结果见图 2。由检测结果可以看出，子座和虫体相比，其中，Cu、Cd和Pb元素在子座中的含量最高，有1批子座Hg元素含量较高，而As元素在虫体中的含量大于子座中的含量。
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图 2 虫体和子座中元素含量对比 Fig.2 Comparison of contents in worm and stroma |
冬虫夏草药材重金属及有害元素评价采用现行2015年版《中国药典》植物药重金属及有害元素的限量标准，参照表 3，同样采用单项污染指数和内梅罗综合污染指数法进行评价。根据单项污染指数评价结果（表 7），冬虫夏草药材中Pb、Cd、Hg和Cu单项污染指数平均值分别为0.23、0.33、0.12和0.69，污染程度均达到安全水平，而As单项污染指数平均值为4.72，污染程度处于重度污染水平，综合来看冬虫夏草主要产地的内梅罗综合污染指数为3.45，重金属及有害元素污染等级为Ⅴ级，总体处于重度污染水平。总的来看，冬虫夏草药材5种重金属及有害元素平均单项污染指数由大小顺序为As、Cu、Cd、Pb、Hg，其中As是主要的污染物，而Pb、Cd、Hg和Cu则基本不存在污染情况。
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表 7 冬虫夏草药材中5种重金属及有害元素单项污染指数和内梅罗综合污染指数评价结果 Tab.7 Evaluation results of single factor pollution index and comprehensive pollution index for 5 heavy metals and harmful element in Cordyceps |
根据本研究结果，按照《土壤环境质量标准》（GB15618-1995）一级标准，Pb、Cd、As是主要的土壤重金属及有害元素污染物，而重金属Hg和Cu在主要产地土壤中则基本不存在污染情况。按照现行2015年版《中国药典》植物药重金属及有害元素的限量标准，在冬虫夏草药材中，As是主要的药材重金属及有害元素污染物，而重金属Pb、Cd、Hg和Cu在药材中则基本是安全的。而由数据发现，主要产地土壤和药材As均严重超标，达到重度污染水平，由此看出冬虫夏草药材中As污染与土壤密不可分。目前，多数文献报道植物对重金属及有害元素的富集机制[16-18]，但均未报道有关冬虫夏草菌丝体对重金属及有害元素的作用，此方面有待进一步研究。另外，由于As元素在自然界以不同的形态和价态存在，其毒性并不一致，无机砷毒性远远大于有机砷毒性，根据文献报道[19-20]及前期相关研究，冬虫夏草中毒性较大的无机砷含有量较低，而且毒性较小的二甲基砷（DMA）和一甲基砷（MMA）也未检出，大部分以其他未知砷形态存在，后续工作中，还需继续研究冬虫夏草中未知形态的砷化合物。
中药材重金属及有害元素污染来源广泛，就其产地土壤检测结果来看，目前主要污染源是土壤；为防止中药材受重金属及有害元素的污染，防控措施应从每个可控的环节着手，包括：1）中药材的生长依赖于土壤，土壤不受污染是保证中药材产量和质量的重要途径，推行符合GAP要求的中药材种植基地，严格控制基地的土壤、水分中重金属及有害元素的含量是保障中药材不受污染的重要条件。2）规范炮制过程，减少防腐剂和干燥剂等试剂的使用，防止中药材的二次污染。3）规范储藏和运输过程，按照《中国药典》规范储藏，尽量减少储藏和运输程序，降低人为因素对其造成的污染。重金属及有害元素含量是中药材品质的重要体现，在质量控制方面应该引起足够的重视。
本研究初步明确冬虫夏草产地土壤和药材中As及其他元素污染情况，为日后冬虫夏草中As超标问题的进一步研究提供了科学依据。
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