2019, Vol. 39 
丹参片是由单味丹参（Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma）经提取后制成的中药成方制剂，具有活血化瘀的作用，用于瘀血闭阻所致的胸痹，症见胸部疼痛、痛处固定、舌质紫暗，冠心病心绞痛见上述证候者[1]，在临床上广泛用于治疗各种心血管系统疾病[2-4]，现收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部，其中含量测定项为HPLC法测定丹参中丹酚酸B的含量，而丹参片的另一类主要成分即脂溶性成分未作相应的含量测定控制。另据文献报道[5-17]，有采用HPLC法对丹参片中部分水溶性成分或部分脂溶性成分含量测定的研究；李耿等[18]采用UPLC法在检测波长分别为265 nm和280 nm下同时测定丹参药材中包括咖啡酸在内的多种成分的含量。目前尚未见采用UPLC法在单波长为280 nm下同时测定丹参片中包括熊果酸在内的多种成分含量的研究报道。本实验参考相关文献[5-18]，对本次国家评价性抽验的8个厂家74批次丹参片样品采用UPLC法在检测波长为280 nm下同时进行了11个成分含量测定的研究，在29 min内能快速准确地测定丹参片中丹参素钠、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮ⅡA、熊果酸、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A共11个成分的含量。通过方法学验证，该方法操作简便、准确，重复性好，可有效地提高丹参片的质量标准，节约分析时间，为丹参片的质量监管提供科学依据。
1 仪器与试药安捷伦公司UPLC Agilent Technologies 1290 lnfinity系统，瑞士梅特勒公司Mettler AE240电子天平。对照品丹参素钠（批号110855-201311）、迷迭香酸（批号111871-201102）、丹酚酸B（批号111562-201514）、丹参酮ⅡA（批号110766-201520）、原儿茶醛（批号110810-200506）、丹参酮Ⅰ（批号110867-200406）、隐丹参酮（批号110852-200806）、熊果酸（批号110742-200518）均购自中国食品药品检定研究院，紫草酸（批号28831-65-4）、丹酚酸A（批号96574-01-5）、二氢丹参酮Ⅰ（批号87205-99-0）均购自西亚公司，质量分数均≥98%；乙腈为色谱醇，实验用水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯；丹参片为2015年国家评价性抽验抽取的样品。
2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 混合对照品溶液精密称取丹参素钠、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮ⅡA、熊果酸、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B及丹酚酸A的对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.812 5、0.143 1、0.253 1、0.367 1、0.360 6、0.384 4、0.143 9、0.632 4、0.412 5、1.132 5、0.764 7 mg·mL-1的混合溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液取样品适量，糖衣片除去糖衣，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇水溶液50 mL，称量，超声（功率280 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷至室温，再称量，用75%甲醇水溶液补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.2 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.1.3 阴性样品溶液取由宁夏启元国药有限公司提供的缺丹参的阴性样品，按“2.1.2”项下的方法操作，即得。
2.2 色谱条件采用Waters ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0~13 min，5%B→22%B；13~16 min，22%B→40%B；16~20 min，40%B→53%B；20~39 min，53%B→80%B），流速0.3 mL·min-1，柱温20 ℃，样品管理器温度4 ℃，检测波长280 nm。色谱图见图 1。
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1.丹参素钠（danshensu sodium）2.原儿茶醛（protocatechuic aldehyde）3.迷迭香酸（rosmarinic acid）4.紫草酸（lithospermic acid）5.丹酚酸B（salvianolic acid B）6.丹酚酸A（salvianolic acid A）7.二氢丹参酮（dihydrotanshinone）8.丹参酮（tanshinone）9.隐丹参酮（cryptotanshinone）10.熊果酸（ursolic acid）11.丹参酮ⅡA（tanshinone ⅡA） 图 1 混合对照品（A）、丹参片样品（B）、阴性样品（C）色谱图 Fig.1 UPLC chromatograms of mixed reference substances(A), Danshen tablet sample(B), and negative sample without Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma(C) |
取混合对照品溶液，分别进样0.25、0.5、1、2、5、8、10 μL，由峰面积（Y）对进样量（X）求得工作曲线，得到丹参素钠、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮ⅡA、熊果酸、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A的回归方程：
Y=2 234.1X-11.936 r=1.000
Y=4 729.1X-2.868 1 r=0.999 9
Y=3 390.1X-11.004 r=1.000
Y=20 720X-176.28 r=0.999 7
Y=11 548X+38.706 r=0.999 9
Y=223.81X-3.621 r=0.999 9
Y=10 776X+0.947 7 r=0.999 9
Y=1 195.5X-7.789 2 r=1.000
Y=1 516.8X-7.963 7 r=0.999 9
Y=1 913.3X+6.303 4 r=1.000
Y=3 712.4X+38.304 r=0.999 9
线性范围分别为0.203 1~8.125、0.035 8~1.431、0.063 3~2.531、0.091 8~3.671、0.090 2~3.606、0.096 1~3.844、0.036 0~1.439、0.158 1~6.324、0.103 1~4.125、0.283 1~11.325和0.191 2~7.647 μg。
2.4 精密度试验取混合对照品溶液，连续进样6次，每次2 μL，测定峰面积值，结果丹参素钠、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮ⅡA、熊果酸、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A峰面积的RSD分别为0.73%、0.60%、0.74%、0.050%、0.67%、1.0%、0.71%、0.41%、0.68%、0.16%、0.96%，表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验取同一供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h进样2 μL进行测定，结果丹参素钠、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮ⅡA、熊果酸、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A峰面积的RSD分别为0.031%、0.13%、0.17%、0.12%、0.50%、1.0%、0.23%、0.11%、0.68%、0.11%、0.070%，表明供试品溶液中的11个待测成分在室温放置24 h内基本稳定。
2.6 重复性试验取同一批丹参片样品（批号150305），按“2.1.2”项的方法平行制得6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样2 μL进行测定并计算，结果丹参素钠、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮ⅡA、熊果酸、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A平均含量值分别为7.009、0.688、1.544、0.882、1.650、2.792、0.799、3.275、3.048、35.48、4.438 mg·g-1，RSD分别为0.011%、0.032%、0.031%、0.40%、0.012%、0.020%、0.091%、0.052%、0.090%、0.011%、0.022%，表明其重复性良好。
2.7 回收率试验取已测知含量的丹参片样品（批号150305）适量，精密称取6份，每份0.1 g（约相当于丹参素钠、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮ⅡA、熊果酸、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A的量分别为0.701、0.069、0.154、0.088、0.165、0.279、0.080、0.328、0.305、3.548、0.444 mg），置具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照品溶液10 mL（丹参素钠、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮ⅡA、熊果酸、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A质量浓度分别为71.21、7.08、15.62、8.72、16.54、27.66、8.12、32.81、30.59、354.03、44.52 μg·mL-1），精密加入75%甲醇水溶液50 mL，按“2.1.2”项下的方法制备供试溶液，进样2 μL进行测定。结果丹参素钠、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮、丹参酮ⅡA、熊果酸、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A平均回收率（n=6）分别为99.2%、99.7%、99.8%、98.9%、99.5%、99.4%、99.6%、99.5%、98.7%、99.3%和98.9%，RSD分别为0.49%、0.44%、0.19%、0.61%、0.63%、0.29%、0.79%、0.48%、0.92%、0.40 %和0.88%，表明该方法的回收率良好。
2.8 样品的测定取8个厂家74批次丹参片样品，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样2 μL进行测定，用外标法计算含量，结果见表 1、图 2。
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表 1 丹参片中11个成分的含量测定结果（mg·g-1） Tab.1 The contents of eleven ingredients in Danshen tablets |
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图 2 水溶性成分含量（A）、脂溶性成分含量（B）及8个厂家丹参片中11个成分总量（C）箱形图 Fig.2 Box charts of water-soluble composition contents(A), fat-soluble composition contents(B)and total quantity of 11 ingredients in Danshen tablets from 8 factories(C) |
从表 1、图 2中丹参片11个成分含量测定结果对比分析可知：丹参片中水溶性成分的含量明显高于脂溶性成分的含量；8个厂家74批次丹参片中11个成分总量差异明显，B企业样品中11个成分总量明显高于其他企业；F企业和H企业11个成分总量也较高，批间差异也较小；D企业和G企业样品中11个成分总量居中，但存在明显的批间差异；A企业、C企业和E企业样品中11个成分总量明显偏低，E企业9批次样品中均未检出原儿茶醛，其中6批次样品未检出隐丹参酮，C企业5批次样品中有4批次未检出原儿茶醛和隐丹参酮。
3.2 水溶性成分含量高于脂溶性成分含量的原因分析从生产工艺的研究和前期调研可知，90%的乙醇提取时，水溶性成分和脂溶性成分均能提出，水作溶剂提取时只有水溶性成分提出，而现行标准中丹参片的生产工艺为90%的乙醇提取1.5 h后，滤过，滤液浓缩成稠膏，药渣再用水煎煮1 h，滤液与浓缩稠膏合并浓缩后再加辅料制片，所以最后的成品中水溶性成分的含量明显高于脂溶性成分的含量。
3.3 不同厂家不同批次间含量差异明显的原因分析B企业的样品中11个成分总量明显高于其他企业，这可能与其较高的质量标准有关，该企业的质量标准中同时规定了丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量测定，对丹酚酸B含量限度规定为本品每片含丹参以丹酚酸B（C36H30O16）计，不得少于13.0 mg，对丹参酮ⅡA的含量限度规定为每片含丹参以丹参酮ⅡA（C19H18O3）计，不得少于0.20 mg；而《中华人民共和国药典》标准的限度规定为本品每片含丹参以丹酚酸B（C36H30O16）计，不得少于11 mg，对丹参酮类成分未作含量测定。F企业和H企业11个成分总量也较高，批间差异也较小，从函调的结果可知，F企业和H企业对生产工艺的每个环节的参数均作了严格的规定和控制。说明质量标准是药品质量中重要的保证手段，生产过程中生产工艺的控制则是保证质量稳定的关键。
3.4 含量差异对临床疗效的影响丹参片作为传统中药制剂，对治疗心脑血管疾病具有良好疗效，临床应用广泛，但研究表明，不同厂家生产的丹参片制剂质量参差不齐，含量的高低直接影响到临床疗效的好坏，而含量的稳定性又有助于保证临床用药安全。
3.5 提取溶剂的选择分别以甲醇及50%甲醇、70%甲醇、75%甲醇、90%甲醇水超声提取30 min，结果以75%甲醇水提取效率最高，故选择75%甲醇水为提取溶剂。
3.6 提取方法的选择以75%甲醇水为提取溶剂，分别超声15、30、60 min及加热回流0.5、1、2 h。实验结果表明，超声提取与加热回流提取效果相当，超声30 min与60 min效果相当，故提取方法确定为超声提取30 min。
3.7 流动相种类的选择分别以甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水为流动相对供试品溶液进行了含量测定，实验结果表明，采用乙腈-0.1%磷酸水作为流动相效果最佳。
3.8 流动相梯度的选择以梯度分别为（0~60 min，2%B→85%B）、（0~40 min，5%B→85%B）、（0~20 min，5%B→53%B；21~40 min，53%B→80%B）、（0~16 min，5%B→45%B；16~25 min，45%B→50%B；25~39 min，50%B→80%B）、（0~13 min，5%B→22%B；13~16 min，22%B→40%B；16~20 min，40%B→53%B；20~39 min，53%B→80%B）的0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相对供试品溶液进行了含量测定，试验结果表明，以梯度为（0~13 min，5%B→22%B；13~16 min，22%B→40%B；16~20 min，40%B→53%B；20~39 min，53%B→80%B）的0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）作为流动相效果最佳，所有色谱峰均在29 min内能得到较好的分离。
3.9 检测波长的选择采用UPLC-DAD检测器，设定波长范围200~400 nm对样品进行扫描，实验结果表明，当λ=280 nm时样品的吸收峰最多，峰形最好，因此选用280 nm作为11个成分含量测定的检测波长。
3.10 小结出现不同厂家以及同一厂家不同批次丹参片中11个成分含量差异较大的原因，作者认为主要与丹参药材的质量、丹参片的质量标准和生产工艺有关。因为同一种药材，不同来源、不同产地、不同采收时间、不同加工方法等因素的影响，均会导致药材质量差异较大。另外，在调研过程中发现，不同厂家在丹参片生产过程中的收膏、配料、制粒、干燥、总混、压片和包装等生产工艺上存在很大的差别。因此，厂家生产工艺欠妥也会造成有效成分的损失，从而导致丹参片的11个成分含量差别较大。
3.11 建议中药的活性成分是多个成分的复合体。丹参片现行标准中含量测定中只对单一的水溶性成分丹酚酸B进行了含量控制，而未对另一类脂溶性成分从量上加以控制，不能真实反映丹参片质量好坏。建议完善质量标准，增加检验项目，建立一测多评方法多指标控制丹参片质量。同时生产厂家要重视药材来源及质量，完善制备工艺，严格按照法定生产工艺生产，控制好中间体质量，提高其产品质量。
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