期刊检索:
  药物分析杂志   2019, Vol. 39 Issue (4): 644-651.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.04.09
0

标准研讨

引用本文 [复制中英文]

兰贺燕, 阎姝, 汤湧. HPLC方法同时测定清热利胆片中10个成分含量[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(4): 644-651. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.04.09.
[复制中文]
LAN He-yan, YAN Shu, TANG Yong. Simultaneous determination of ten components in Qingre Lidan tablets by HPLC[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39(4): 644-651. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.04.09.
[复制英文]

基金项目

天津市卫生和计划生育委员会中西医结合重点项目(2017034)

第一作者

兰贺燕, Tel:15028280759;E-mail:896673291@qq.com

通信作者

阎姝, Tel:13389989966, E-mail:yjknkyy@126.com

文章历史

收稿日期:2018-08-04
HPLC方法同时测定清热利胆片中10个成分含量
兰贺燕 1, 阎姝 2, 汤湧 2    
1. 天津医科大学, 天津 300070;
2. 天津市南开医院, 天津 300100
摘要目的:建立同时测定清热利胆片中绿原酸、迷迭香酸、黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚10个指标成分含量的HPLC方法。方法:采用WondaSil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以0.3%磷酸水溶液(A)-甲醇(B)为流动相进行梯度洗脱,流速1 mL·min-1,柱温37℃,检测波长分别为327 nm(绿原酸、迷迭香酸)、280 nm(黄芩苷)、254 nm(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)和294 nm(和厚朴酚、厚朴酚)。结果:清热利胆片中10个指标成分可实现完全分离,在一定的浓度范围内线性关系良好。方法的精密度、稳定性、重复性符合《中华人民共和国药典》2015年版中药品质量标准分析方法验证指导原则(四部9101)的要求(RSD ≤ 2.0%);平均回收率(n=6)在94.8%~99.5%范围内,RSD在0.93%~2.1%范围内。3批清热利胆片中绿原酸、迷迭香酸、黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚的含量范围分别为0.281~0.320、0.252~0.281、1.876~2.090、0.127~0.144、0.178~0.198、0.146~0.163、0.492~0.565、0.122~0.142、0.630~0.673、0.954~1.014 mg·片-1结论:该方法能够用于同时检测清热利胆片中10个化学成分。
关键词清热利胆片    医疗机构制剂    绿原酸    迷迭香酸    黄芩苷    芦荟大黄素    大黄酸    大黄素    大黄酚    大黄素甲醚    和厚朴酚    厚朴酚    含量测定    高效液相色谱    
Simultaneous determination of ten components in Qingre Lidan tablets by HPLC
LAN He-yan1, YAN Shu2, TANG Yong2    
1. Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China;
2. Tianjin Nankai Hospital, Tianjin 300100, China
Abstract: Objective: To develop an HPLC method for the determination of chlorogenic acid, rosmarinic acid, baicalin, aloe-emodin, rhein, emodin, chrysophanol, physcion, honokiol and magnolol in Qingre Lidan tablets.Methods: The analysis was performed on a WondaSil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) eluted with mobile phase of 0.3%phosphoric acid aqueous solution (A) and methanol (B) in a linear gradient mode. The flow rate was kept at 1 mL·min-1 and the column temperature was set at 37℃. The detector wavelengths were 327 nm (chlorogenic acid, rosmarinic acid), 280 nm (baicalin), 254 nm (aloe-emodin, rhein, emodin, chrysophanol, physcion) and 294 nm (honokiol, magnolol).Results: 10 selected components in Qingre Lidan tablets were separated satisfactorily. All the components exhibited good linear correlation in the given concentration range (r=0.999 9-0.999 3). The precision, stability and repeatability were all fit to the requirement of the guiding principle about the methodology validation in Chinese Pharmacopoeia (Edition 2015) (RSD ≤ 2.0%). The average recoveries (n=6) of the 10 components were 94.8%-99.5%with the RSD of 0.93%-2.1%. Three batches of samples were tested and the contents of ten components were between 0.281-0.320, 0.252-0.281, 1.876-2.090, 0.127-0.144, 0.178-0.198, 0.146-0.163, 0.492-0.565, 0.122-0.142, 0.630-0.673 and 0.954-1.014 mg per tablet, respectively.Conclusion: This method is suitable for simultaneous determination of 10 contents in Qingre Lidan tablets.
Keywords: Qingre Lidan tablets    medical institution preparation    chlorogenic acid    rosmarinic acid    baicalin    aloe-emodin    rhein    emodin    chrysophanol    physcion    honokiol    magnolol    assay    high performance liquid chromatography    

清热利胆片(津药制字Z20070523号)为医疗机构制剂[1],其处方是在古方“茵陈蒿汤”和“大承气汤”基础上进行加减而成,包含了茵陈、夏枯草、黄芩、大黄、厚朴等6味药材,临床用于治疗急性单纯性胆囊炎、胆管炎,轻度化脓性胆囊炎、胆管炎,急性胆囊胰腺炎,胆道术后综合症等。茵陈蒿汤来源于汉代张仲景的《伤寒论》,茵陈蒿为其君药,善于清热利湿、退黄疸,大黄为佐药,善于泄热逐瘀、通利大便[2-3]。大承气汤亦出自张仲景的著作,在《伤寒论》和《金匮要略》都有记载,具有峻下热结的功效。现代研究表明,茵陈和大黄均能促进胆汁酸排泄,阻止胆汁淤积造成的肝细胞损伤[4-5],其机理包括激活CAR,PXR等核受体[6]以及上调肝脏多药耐药蛋白2(MRP2)[4],其物质基础包括香豆素类、绿原酸、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素和鞣质等[7]。黄芩则具有较强的抗氧化[8]和抗炎作用[9],在制剂处方中发挥保肝功能。

新颁布的“中医药法”规定“国家鼓励医疗机构根据本医疗机构临床用药需要配制和使用中药制剂,支持以中药制剂为基础研制中药新药”。现行清热利胆片的质量标准最初收载于“天津市医疗机构制剂规范2008版”中,该质量标准存在如下缺陷:(1)包括薄层色谱定性鉴别在内,仅对构成清热利胆片的6味中药中的3味(黄芩、大黄、厚朴)进行了检测,特别是对制剂处方中起重要作用的“茵陈”没有进行检测;(2)“含量测定”项选择了来源于大黄的“大黄素、大黄酚”进行定量分析(以二者含量总合计),而现行《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)以5个大黄蒽醌含量之和作为大黄定量分析的指标,并未对“大黄素、大黄酚”的含量单独进行限定,导致实际工作中可能会出现使用的原料大黄质量合格而清热利胆片成品含量测定结果不合格的情况;(3)定量检测的指标成分过少。本文参照同类药物文献报道[10-11],提出使用梯度洗脱、多波长检测方法同时测定清热利胆片中来源于5种药味的10个指标成分含量。该方法除了可以实现尽可能多地定量测定清热利胆片中化学成分的目的外,还可以完全替代原质量标准中的薄层色谱定性鉴别相关内容,减轻质检人员工作量,缩短检验时间。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪(配备G1379 A在线脱气机,G1311A四元梯度泵,G1313A自动进样器,G1316A柱温箱,G1315B DAD检测器,Agilent色谱工作站);BP211D十万分之一电子天平(德国赛多利斯);KQ-700GDV超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司);对照品绿原酸(批号110753-201415,含量以96.20%计)、迷迭香酸(批号20283-92-5,含量以98.30%计)、黄芩苷(批号110715-201318,含量以93.30%计)、芦荟大黄素(批号110795-201710,含量以98.30%计)、大黄酸(批号110757-200206,含量以99.30%计)、大黄素(批号110756-201512,含量以98.30%计)、大黄酚(批号110796-201621,含量以99.20%计)、大黄素甲醚(批号110758-201415,含量以99.10%计)、和厚朴酚(批号110730-201614,含量以99.10%计)、厚朴酚(批号110729-201513,含量以98.80%计)均由中国食品药品检定研究院提供。清热利胆片(标示片重0.3 g)由天津市南开医院提供。甲醇为色谱纯(霍尼韦尔贸易有限公司),水为超纯水,其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品溶液

精密称取绿原酸、迷迭香酸、黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚的对照品适量,加甲醇配制成每1 mL分别含上述10个成分31.86、27.48、256.58、18.09、25.34、21.31、54.68、24.30、77.20、139.21 μg的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液8 mL,置25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

取清热利胆片4片,称量,计算平均片重,研细,过80目筛,取粉末约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加甲醇20 mL,25 ℃下超声(700 W,40 kHz)提取45 min,放冷,过滤。用约2 mL甲醇洗涤残渣2次,合并滤液,用甲醇定容至25 mL,0.22 μm滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.1.3 阴性样品溶液

根据清热利胆片处方,模拟其制备工艺,分别制备不含茵陈、夏枯草、黄芩、大黄、厚朴的阴性样品,依照“2.1.2”项下方法分别制成相应阴性样品溶液。

2.2 方法学考察 2.2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱:WondaSil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:0.3%磷酸水溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0~18 min,23%B→24%B;18~24 min,24%B→33%B;24~47 min,33%B→ 40%B;47~50 min,40%B→48%B;50~58 min,48%B→54%B;58~60 min,54%B→57%B;60~70 min,57%B→67%B;70~83 min,67%B→75%B;83~93 min,75%B→79%B;93~96 min,79%B→85%B;96~100 min,85%B→89%B;100~104 min,89%B→95%B);流速:1.0 mL·min-1;柱温:37 ℃;检测波长分别为327 nm(绿原酸、迷迭香酸),280 nm(黄芩苷),254 nm(芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚),294 nm(和厚朴酚、厚朴酚);进样量:10 μL。

2.2.2 专属性试验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL,在“2.2.1”项色谱条件下分别注入色谱仪,得相应的色谱图,见图 1。在上述色谱条件下,绿原酸、迷迭香酸、黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚均达到基线分离,各成分之间无干扰。

1.绿原酸(chlorogenic acid)2.迷迭香酸(rosmarinic acid)3.黄芩苷(baicalin)4.芦荟大黄素(aloe-emodin)5.大黄酸(rhein)6.和厚朴酚(honokiol)7.厚朴酚(magnolol)8.大黄素(emodin)9.大黄酚(chrysophanol)10.大黄素甲醚(physcion) 图 1 混合对照品(A、B、C、D)、样品(E、F、G、H)、阴性样品(I.无茵陈;J.无夏枯草;K.无黄芩;L.无大黄;M.无厚朴)色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A, B, C, D), samples(E, F, G, H)and negative samples(I.without Artemisiae Scopariae Herba; J.without Prunellae Spica; K.without Acutellariae Radix; L.without Rhei Radix et Rhizome; M.without Magnoliae Officinalis Cortex)
2.2.3 线性关系考察

精密量取混合对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL,分别用甲醇定容于10 mL量瓶中,摇匀,即得系列混合对照品溶液。按“2.2.1”项的色谱条件对上述系列混合对照品溶液以及混合对照品储备液进行测定,并绘制出横、纵坐标分别为对照品进样量X(μg)和峰面积Y的标准曲线,得回归方程、线性范围及相关系数见表 1

表 1 10个成分的标准曲线方程、相关系数(r)和线性范围 Tab.1 Regression equations, correlation coefficients(r)and linear ranges of ten components
2.2.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次进行测定,记录绿原酸、迷迭香酸、黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积,计算得RSD分别为1.3%、0.62%、0.61%、1.1%、1.0%、1.2%、0.99%、1.5%、0.46%、0.69%,表明仪器的精密度良好。

2.2.5 重复性试验

取同一批号(20170724)清热利胆片样品粉末约0.3 g,6份,精密称定,按“2.1.2”项下方法分别制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。绿原酸、迷迭香酸、黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚及厚朴酚的平均含量分别为0.279、0.260、2.044、0.139、0.195、0.164、0.508、0.137、0.652、1.008 mg·片-1,RSD分别为1.3%、1.3%、0.84%、1.4%、0.98%、1.6%、1.0%、2.0%、1.2%、0.89%,表明方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液,分别于配制后0、3、6、10、16、24 h按“2.2.1”项下色谱条件进行测定,记录绿原酸、迷迭香酸、黄芩苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、和厚朴酚、厚朴酚的峰面积,计算得RSD分别为1.0%、1.9%、0.65%、1.3%、1.2%、1.6%、1.0%、1.7%、1.1%、0.68%,表明供试品溶液中待测成分在24 h内稳定性良好。

2.2.7 加样回收率试验

取同一批号(20170724)含量已知的样品6份,每份约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,分别加入混合对照品储备液8 mL和甲醇32 mL。按“2.1.2”项下方法所述,分别在25 ℃下超声(700 W,40 kHz)提取45 min,放冷,过滤,用约2 mL甲醇甲醇洗涤残渣2次,合并滤液,用甲醇定容至50 mL,0.22 μm滤膜过滤,取续滤液,按上述色谱条件进行测定。计算出各成分的加样回收率,结果见表 2

表 2 加样回收率试验结果 Tab.2 Recovery results by standard addition method
2.2.8 样品测定

取3个批号(批号分别为20170619、20170724、20170912,平均片重分别为0.305、0.303、0.302 g·片-1)的清热利胆片,按“2.1.2”项下方法分别制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,以外标法计算含量,结果见表 3

表 3 含量测定结果 Tab.3 Results of content in samples
3 讨论 3.1 指标成分的选择

清热利胆片处方药味组成与2015年版《中国药典》中收载的“利胆排石片”、“利胆排石颗粒”类似,主要是将原方的10味药简化到了5味,同时增加了夏枯草1味药材。如前所述,原清热利胆片质量标准中含量测定项仅检测了大黄素、大黄酚的含量,不能有效表征产品质量情况。近年来,多篇文献报道了利胆排石片多组分含量测定方法,对于上述5种药味,郭琪等[12]同时测定了其中来自于茵陈、黄芩、大黄的指标成分含量,杨跃华等[13]同时测定了其中来自厚朴、大黄的指标成分含量,本实验综合上述文献方法,同时选定茵陈、黄芩、厚朴、大黄4种药味的指标成分为含量测定对象,加上来自于夏枯草的迷迭香酸,共选取了来自于组成清热利胆片6味药物中5味的10个指标成分作为定量分析对象。

3.2 提取方法的选择

中药制剂含量测定中最常用的提取方法是超声提取法和加热回流提取法。具体到清热利胆片,待测成分绿原酸、迷迭香酸、和厚朴酚、厚朴酚均含有易氧化的酚羟基,前二者还含有易水解、醇解的酯键,通常不能耐受加热回流条件。因此本实验选择了超声提取法。查阅了相关文献,发现含有上述几种成分的制剂在含量测定中也多用超声提取法[12-14]。对比了不同超声时间对提取率的影响,发现超声45 min以上时提取率不再提高,为求充分提取,选择了45 min的超声处理时间。考虑到待测组分中的和厚朴酚、厚朴酚均属于热不稳定组分,将超声温度限定在25 ℃下。

3.3 流动相、梯度、柱温的优化

实验对比了以甲醇和乙腈为有机相时待测组分的分离情况。结果表明以乙腈作为有机相时和厚朴酚、厚朴酚以及大黄蒽醌各成分的峰形较差。这可能是因为以乙腈为有机相时初始流动相组成中水相比例很大(92%),而样品的溶剂为纯甲醇,样品中上述几个组分在水中溶解性很差。相较而言,以甲醇为有机相时初始流动相组成中有机成分比例较高,有利于提高前述组分的溶解度。在HPLC方法中,样品的溶剂最好尽可能接近流动相,使用流动相溶解样品是最好的选择。

为了在提高待测组分分离度的同时尽可能压缩总的分析时间,实验采用了阶梯式洗脱方法,即将洗脱过程划分为出峰区和过渡区,在出峰区采取小梯度或等度洗脱以提高分离度,在过渡区采取大梯度以压缩分析时间。由于总的分析时间较长,为了改善峰形,防止拖尾,在分析条件摸索过程中逐步增大了水相中磷酸含量,提高了柱温,结果发现水相中磷酸含量为0.3%,柱温为37 ℃时分离度合格,色谱峰无明显拖尾。进一步增加磷酸含量和提高柱温对改善峰形效果不明显。

3.4 检测波长的选择

本实验的检测波长首先依据各组分对应单味药材在药典中规定的定量检测波长进行选择。实验结果表明,迷迭香酸在330 nm和327 nm处的吸收几乎相同,因此将迷迭香酸检测波长设定为327 nm,与绿原酸合并。和厚朴酚、厚朴酚、黄芩苷在254 nm处虽也有较强吸收,但相对于最佳检测波长,其吸收峰面积明显较小,杂质峰干扰相对较强,因此仍维持在各自最佳检测波长进行检测。

4 小结

本实验建立了同时测定清热利胆片中10个成分的HPLC方法,方法学验证结果符合《中国药典》2015年版中质量分析方法验证指导原则(四部9101)的要求。测定结果准确可靠,可用于对清热利胆片的含量测定及质量控制。

参考文献
[1]
天津市医疗机构制剂规范.2016年版[S].2016: 274
Preparation Standards for Medical Institutions in Tinjin[S].2016: 274
[2]
杨爱华.茵陈蒿汤药效部位筛选及配伍机理初步研究[D].南京: 南京中医药大学, 2013
Yang ah.Effective Fraction Screen and Preliminary Study on Compatibility Mechanism of Yinchenhao Decoction[D].nanjing: Nanjing University of Chinese Medicine, 2013
[3]
候金燕, 窦志华. 茵陈蒿汤保肝作用研究进展[J]. 中医药导报, 2015, 21(19): 88.
Hou jy, dou zh. Research progress on hepatoprotective effect of Yinchenhao decoction[J]. guid j tradit chin med pharm, 2015, 21(19): 88.
[4]
Liu J, Hou LL, Zhao CY. Effect of YHHJ on the expression of the hepatocellular bile acid transporters multidrug resistance-associated protein 2 and bile salt export pump in ethinylestradiol-induced cholestasis[J]. Exp Ther Med, 2018, 15(4): 3699.
[5]
Yang Q, Yang F, Tang X, et al. Chlorpromazine-induced perturbations of bile acids and free fatty acids in cholestatic liver injury prevented by the Chinese herbal compound Yin-Chen-Hao-Tang[J]. BMC Complement Altern Med, 2015, 15: 122. DOI:10.1186/s12906-015-0627-2
[6]
Huang W, Zhang J, Moore DD. A traditional herbal medicine enhances bilirubin clearance by activating the nuclear receptor CAR[J]. J Clin Invest, 2004, 113(1): 137. DOI:10.1172/JCI200418385
[7]
华圆, 冯健, 李范珠. 茵陈蒿汤利胆退黄物质基础的研究进展[J]. 中华中医药学刊, 2011, 29(7): 1520.
Hua y, feng j, li fz. Progress in study on cholagogue active components of Yinchenhao decoction[J]. Clin Arch Tradit chin med, 2011, 29(7): 1520.
[8]
Cheng F, Wang Y, Li J, et al. Berberine improves endothelial function by reducing endothelial microparticles-mediated oxidative stress in humans[J]. Int J Cardiol, 2013, 167(3): 936. DOI:10.1016/j.ijcard.2012.03.090
[9]
唐彬, 宋振梅, 肖琦凡. 黄芩苷对高脂-脂肪肝模型大鼠肝脏炎症改善及炎性因子表达的影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2017, 53(6): 659.
Tang B, song zm, xiao qf. Effect of balcalin on the improvement of liver inflammation and the expression of inflammatory factors in a rat model of hyperlipidemia-fatty liver disease[J]. J Qingdao Med Univ, 2017, 53(6): 659.
[10]
王韵, 赵亮, 柴逸峰, 等. RP-HPLC法同时测定茵陈蒿汤中14个成分[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(3): 393.
Wang y, zhao l, chai yf, et al. Simultaneous determination of fourteen constituents in Yin-Chen-Hao-Tang by RP-HPLC[J]. chin J Pharm Anal, 2017, 37(3): 393.
[11]
杨佩磊, 蔡咏梅. HPLC法同时测定厚朴排气合剂中和厚朴酚、厚朴酚、大黄素和大黄酚的含量[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(5): 922.
Yang pl, cai ym. Simultaneous determination of honokiol, magnolol, emodin and chrysophanol in Houpopaiqi mixture by HPLC[J]. chin J Pharm Anal, 2017, 37(5): 922.
[12]
郭琪, 王海波, 李向阳, 等. HPLC法同时测定利胆排石片中14个成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(4): 631.
Guo q, wang hb, li xy, et al. Simultaneous determination of 14 components in Lidanpaishi tablets by HPLC[J]. chin J Pharm Anal, 2017, 37(4): 631.
[13]
杨跃华, 胡春丽, 张洪霞, 等. RP-HPLC法同时测定利胆排石片中5种有效成分的含量[J]. 沈阳药科大学学报, 2012, 29(5): 373.
YANG YH, HU CL, ZHANG HX, et al. Simultaneous determination of five constituents in Lidanpaishi tablets by RP-HPLC[J]. J Shenyang Pharm Univ, 2012, 29(5): 373.
[14]
郝乘仪, 郭淑英, 朱鹤云, 等. 高效液相色谱法同时测定栀子金花丸中9个成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2014, 34(9): 1571.
HAO CY, GUO SY, ZHU HY, et al. Simultaneous determination of nine compounds in Zhizi Jinhua pills by HPLC wavelength switching method[J]. chin J Pharm Anal, 2014, 34(9): 1571.