2019, Vol. 39 
2. 江西中医药大学, 南昌 330004;
3. 浙江医药高等专科学校, 宁波 315100
2. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China;
3. Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo 315100, China
三叶木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.为木通科（Iardizabalaceoe）木通属（Akebia）藤本植物，是2015年版《中华人民共和国药典》收载品种木通的基源植物之一，干燥藤茎入药[1]，主要分布于黄河流域、秦巴山区、长江流域，我国传统医学中把三叶木通的根、茎、果实、种子分别称为木通根、木通、八月扎、预知子[2]。三叶木通具有利尿抗水肿、抗菌消炎、清心除烦、通经下乳的功效，临床上以其良好的利尿作用，广泛地用于治疗淋症、心烦尿赤、水肿、湿热痹痛等[3-4]。三叶木通作为常用中药，目前关于三叶木通质量控制方面的报道主要集中在测定其苯乙醇苷B、木通齐墩果酸、常春藤皂苷的含量[5-9]，未能反映三叶木通的整体质量。三叶木通中主要含有三萜、三萜皂苷、木脂素苷等，研究部位涉及木通属的根、藤茎、果实、种子等[10-13]。本课题组从三叶木通干燥藤茎中分离得到皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A等三萜皂苷类化学成分，文献资料表明木通三萜皂苷类成分具有利尿抗炎等活性[14-15]，为其主要活性成分。目前尚未有文献报道采用TLC法鉴别三叶木通中皂苷PH、皂苷PJ1和HPLC法同时测定三叶木通中皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A的含量，因此，本研究采用上述利尿抗炎活性成分为指标，建立了三叶木通药材中皂苷PH、皂苷PJ1的TLC鉴别方法和同时测定皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A含量的HPLC方法，为进一步完善三叶木通药材的质量评价方法提供参考依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器安捷伦公司Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括G1311C四元泵、在线脱气机、G1315D DAD、G1329B自动进样器、LC1260色谱工作站、G1316A柱温箱；赛多利斯公司Sartorius BT25S电子天平（十万分之一），Sartorius BSA124S-CW电子天平（万分之一）。
1.2 试药对照品皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A为本课题组自制，通过1H-NMR、13C-NMR、MS等手段确证了其结构，经HPLC法检测，纯度均≥98%（面积归一法）。硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂）。乙腈（Sigma公司）为色谱纯，水为Milli-Q超纯水，其他试剂均为分析纯。5批三叶木通药材样品均由江西南昌济生制药厂提供。
2 方法与结果 2.1 薄层色谱鉴别取三叶木通药材粉末（过3号筛）1 g，置具塞锥形瓶中，加入水饱和的正丁醇50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液用氨试液洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，再用正丁醇饱和的水40 mL洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，即得供试品溶液；称取皂苷PH、皂苷PJ1的对照品适量，加甲醇分别制成质量浓度均为1 mg·mL-1的对照品溶液，照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2015年版四部附录）试验，分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5 µL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（20 :10 :1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点清晰，日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（图 1）。
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1.皂苷PH（saponin PH）2.皂苷PJ1（saponin PJ1）3.批号180601样品（lot No.180601 sample）4.批号180714样品（lot No.180714 sample）5.批号171002样品（lot No.171002 sample） 图 1 三叶木通的薄层色谱图 Fig.1 TLC chromatogram of Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz. |
精密称取皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A的对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.201、0.075 5、0.224 3和0.041 4 mg·mL-1的混合溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液取三叶木通药材粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称量，加热回流1 h，放冷，称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸干，残渣加25 mL水使溶解，置于分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，再用正丁醇饱和的水50 mL洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。
2.2.3 色谱条件采用依利特C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，以乙腈-水（21 :79）为流动相，流速1.0 mL·min-1，检测波长200 nm，进样量10 μL；样品色谱中与各对照品对应的色谱峰的理论板数均不低于3 000。在上述色谱条件下，色谱图见图 2。
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1.皂苷PH（saponin PH）2.akemisaponin E 3.皂苷PJ1（saponin PJ1）4. scheffoleoside A 图 2 混合对照品（A）、三叶木通药材（B）色谱图 Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A)and Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.(B) |
精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液1、2、5、10、15、25 µL，分别按“2.2.3”项下色谱条件进样分析，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得4个成分的回归方程，结果见表 1。
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表 1 4个成分的线性关系 Tab.1 Linearity of 4 components |
精密吸取混合对照品溶液10 μL，按“2.2.3”项下色谱条件连续进样6次，依次测定峰面积，结果皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A峰面积的RSD（n=6）分别为0.18%、0.40%、0.17%、0.68%，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验精密吸取供试品溶液10 μL，按“2.2.3”项下色谱条件，于0、1、2、4、8、12、24 h分别进样测定，结果皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A峰面积的RSD（n=7）分别为0.51%、0.44%、0.18%、0.70%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.2.7 重复性试验取同一批（批号为171002）三叶木通药材粉末（过3号筛）6份，各约1 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，测得皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A平均含量（n=6）分别为3.928、1.418、4.472、0.797 mg·g-1，RSD分别为0.39%、0.89%、0.50%、0.85%。
2.2.8 回收率试验精密称取“2.2.7”项下已测知含量的三叶木通药材粉末（过3号筛）6份，每份约0.5 g，精密称定，每份分别精密加入含皂苷PH 40.200 μg·mL-1、akemisaponin E 15.104 μg·mL-1、皂苷PJ1 44.860 μg·mL-1和scheffoleoside A 8.278 μg·mL-1的混合对照品溶液50 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，并按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，计算平均回收率，结果见表 2。
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表 2 回收率试验结果 Tab.2 Results of recovery |
取同一批（批号为171002）三叶木通药材粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别采用依利特C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、岛津Inertsil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）、资生堂CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3种品牌的色谱柱，按“2.2.3”项下色谱条件进行测定，结果无明显差别，表明耐用性良好。
2.2.10 样品含量测定取不同批号的的5批三叶木通药材粉末（过3号筛），每批取3份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.3”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，用外标法计算出皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A的含量，结果见表 3。
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表 3 样品含量测定结果（n=3） Tab.3 Results of content determination of samples |
比较了三氯甲烷-甲醇-甲酸系统及正丁醇-冰醋酸-水系统，结果显示，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（20 :10 :1）为展开剂效果佳，展开时间短。
3.2 薄层色谱鉴别显色剂的考察比较了10%硫酸乙醇试液、5%硫酸香草醛试液，结果显示，10%硫酸乙醇试液显色效果较好。
3.3 检测波长的选择应用DAD检测器在200~400 nm范围内对皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A进行光谱扫描；结果表明，4个成分均在200 nm波长附近有最大吸光系数，故选择200 nm作为检测波长。
3.4 提取方式的考察提取方法考察了回流提取法和超声提取法对皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A含量测定的影响，结果显示，回流提取法提取更完全，故选择回流提取法；提取溶剂考察了水、甲醇溶液（30%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液、甲醇）、乙醇，结果显示，甲醇提取时皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A含量均较高，且干扰少；提取时间考察了0.5、1、1.5 h，结果显示1 h可提取完全；提取体积考察了50、100 mL，结果显示无明显差别，故将提取体积定为50 mL。
3.5 流动相的确定考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液4个溶剂系统，结果显示，以乙腈-水为流动相，所得色谱峰峰形较好，分离效果佳。
3.6 小结本实验建立了三叶木通中皂苷PH和皂苷PJ1的薄层鉴别方法，该法斑点清晰，分离度好；测定了5批三叶木通的皂苷PH、akemisaponin E、皂苷PJ1和scheffoleoside A含量，结果有一定差异，湖北产地的皂苷含量稍微高于安徽产地，可能与不同产地、采收时间有关。本实验所建立的定性定量方法，为进一步完善三叶木通药材的质量评价方法提供参考依据。
| [1] |
中华人民共和国药典2015年版.一部[S].2015: 63 ChP 2015.Vol Ⅰ[S].2015: 63 |
| [2] |
李丽, 陈绪中, 姚小洪, 等. 三种木通属植物的地理分布与资源调查[J]. 武汉植物学研究, 2010, 28(4): 498. LI L, CHEN XZ, YAO XH, et al. Geographic distribution and resource status of three important Akebia species[J]. J Wuhan Bot Res, 2010, 28(4): 498. |
| [3] |
刘桂艳, 王晔, 马双成, 等. 木通属植物木通化学成分及药理活性研究概况[J]. 中国药学杂志, 2004, 39(5): 330. LIU GY, WANG Y, MA SC, et al. Overview of research on chemical constituents and pharmacological activities of Akebia Dence.[J]. Chin Pharm J, 2004, 39(5): 330. DOI:10.3321/j.issn:1001-2494.2004.05.004 |
| [4] |
刘岩庭, 侯雄军, 谢月, 等. 木通属植物化学成分及药理活性研究进展[J]. 江西中医学院学报, 2012, 24(4): 87. LIU YT, HOU XJ, XIE Y, et al. Overview of research on chemical constituents and pharmacological activities of Akebia Dence.[J]. J Jiangxi Univ TCM, 2012, 24(4): 87. DOI:10.3969/j.issn.1005-9431.2012.04.028 |
| [5] |
刘卫国, 杨文珏, 汪晓辉, 等. 高效液相色谱法测定三叶木通中齐墩果酸的量[J]. 时珍国医国药, 2005, 16(8): 747. LIU WG, YANG WJ, WANG XH, et al. Determination of oleanolic acid in Akebia trifoliate by HPLC[J]. LiShizhen Med Mater Med Res, 2005, 16(8): 747. DOI:10.3969/j.issn.1008-0805.2005.08.019 |
| [6] |
成晓霞.三叶木通有效成分含量测定及指纹图谱研究[D].西安: 陕西师范大学, 2008: 34 CHENG XX.The Study on Fingerprint and Determination by HPLC of the Active Constituents from Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.[D].Xi'an: Shaanxi Normal University, 2008: 34 http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10718-2010193761.htm |
| [7] |
欧金梅, 储晓琴, 张虹. 高效液相色谱法测定安徽产木通药材中3种有效成分[J]. 安徽中医药大学学报, 2015, 34(1): 70. OU JM, CHU XQ, ZHANG H. Determination of three active constituents of Akebia Dence.in Anhui province by HPLC[J]. J Anhui Univ Chin Med, 2015, 34(1): 70. DOI:10.3969/j.issn.2095-7246.2015.01.022 |
| [8] |
高慧敏, 王智民, 傅雪涛, 等. RP-HPLC测定木通药材中皂苷类成分的含量[J]. 中国中药杂志, 2007, 42(1): 20. GAO HM, WANG ZM, FU XT, et al. Determination of triterpenoid saponins in Caulis Akebiae by RP-HPLC[J]. China J Chin Mater Med, 2007, 42(1): 20. |
| [9] |
高伟, 幸伟年, 敖婉初, 等. 高效液相色谱法测定木通属植物苯乙醇苷B含量[J]. 南方林业科学, 2015, 43(5): 48. GAO W, XING WN, AO WC, et al. Phenylethanoid glycosides B content of Akebia plants determined by HPLC[J]. South China Forest Sci, 2015, 43(5): 48. |
| [10] |
高慧敏, 王智民. 木通属药用植物研究进展[J]. 中国中药杂志, 2006, 31(1): 10. GAO HM, WANG ZM. Overview of research on chemical constituents of Akebia Dence.[J]. China J Chin Mater Med, 2006, 31(1): 10. DOI:10.3321/j.issn:1001-5302.2006.01.002 |
| [11] |
MATSUZAKI K, MURANO K, ENDO Y, et al. Nortriterpene saponins from Akebia trifoliate[J]. Nat Prod Commun, 2014, 9(12): 1695. |
| [12] |
IWANAGA S, WARASHINA T, MIYASE T. Triterpene saponins from the pericarps of Akebia trifoliata[J]. Chem Pharm Bull, 2012, 60(10): 1264. DOI:10.1248/cpb.c12-00448 |
| [13] |
张宁.三叶木通藤茎HPLC指纹图谱和果实预知子有效成分的研究[D].西安: 陕西师范大学, 2015: 13 ZHANG N.Study on HPLC Fingerprint of Stems and Active Constituents of Fruits from Akebia trifoliata(Thunb.)Koidz.[D].Xi'an: Shaanxi Normal University, 2015: 13 http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10718-2010192258.htm |
| [14] |
CHOI JW, JUNG HJ, LEE KT, et al. Antinociceptive and anti-inflammatory effects of the saponin and sapogenins obtained from the stem of Akebia quinata[J]. Med Food, 2005, 8(1): 78. |
| [15] |
TSEN T. Pharmacological studies on the components of Akebia longeracemosa, especially on the chemical and pharmacological properties of Akebia saponins[J]. Shikoku Igaku Zasshi, 1973, 29(1): 65. |