2019, Vol. 39 
2. 江苏大学, 镇江 212013
2. Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China
蚕沙，为蚕蛾科昆虫家蚕蛾Bomby xmori L.幼虫的干燥粪便，主要产于我国河南、江苏、浙江、四川、湖南、云南、山东、辽宁、广东、安徽、甘肃、湖北、等地[1]，广泛应用于养蚕业中。关于蚕沙的药用功效与主治病症最早可见于《名医别录》记载为“主肠鸣，热中消渴，风痹，瘾疹。”后经整理，在《本草经集注》中录为“多入诸方用，不但熨风而已也”。《本草求真》云：“玩书所着治功，多有祛风除湿之能，因于风湿而至者。所述治症，多为肢节不遂。”《本草拾遗》中明确记载蚕沙可治“腹内宿冷，冷血，疯血”。此外，《泉州本草》谓“治风寒感冒，偏头痛”，《凌临灵方》中以蚕沙、汉防己等为方可治脚气，消水肿。蚕沙的药用形式也较为多样，可内服、外敷、酒制、成散等。关于蚕沙的现代研究表明，蚕沙中资源性化学成分种类丰富，具有抗炎、镇痛、降血糖、保肝等多种药理活性，在农业生产和养殖业中也有广阔的应用前景。
我国桑蚕资源丰富，蚕沙作为桑蚕业的主要副产物，长期以来由于缺乏有效的利用途径造成资源浪费与环境污染。据此，本研究基于资源化学研究思路与方法，建立蚕沙中黄酮类、生物碱类、核苷类、氨基酸类、可溶性多糖类、叶绿素类等多种资源性化学成分的定性定量分析方法，以期阐明各类型成分在不同产地、不同龄期蚕沙中的分布，为我国蚕沙资源的综合利用提供科学依据。
1 实验材料ACQUITYTM UPLC超高效液相色谱系统与XevoTM TQ质谱系统和MasslynX4.1质谱工作站软件（Waters公司）；ML204（万分之一）、MS105（十万分之一）分析天平（梅特勒-托尼多仪器有限公司）；WH-1微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂）；KH-500型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Millipore Direct-Q3 Advantage超纯水系统（密理博有限公司）；Microfuge 22 R Centrifuge离心机（Beckman Coulter公司）；Enspire多功能酶标仪（PerkinElmer公司）；G9双光束紫外可见分光光度计（南京菲勒仪器有限公司）。
黄酮类化学对照品紫云英苷（批号Z-020-123312）、异槲皮苷（批号Y-076-120385）、芦丁（批号LGNR-5N77L），均购自中国食品药品检定研究院；生物碱类化学对照品1-脱氧野尻霉素（批号T-021-120811）购自中国食品药品检定研究院，荞麦碱（批号HY-13005）购自MedChem Express；核苷类、氨基酸类对照品γ-氨基丁酸（批号BCBD3661V）、L-亮氨酸（批号20080318）、L-甲硫氨酸（批号F20080927）、L-苯丙氨酸（批号20090310）、L-色氨酸（批号20090310）、L-苏氨酸（批号20080806）、L-α-丙氨酸（批号20090312）、L-瓜氨酸（批号BCBC7694）、L-谷氨酸（批号20080318）、L-谷氨酰胺（批号BCBC6452V）、L-天冬酰胺（批号021M5416V）、鸟苷（批号119K15841V）、L-缬氨酸（批号20080318）、L-脯氨酸（批号20080219）、胞苷（批号101056876）、腺嘌呤（批号Y09M8C30835）、L-赖氨酸（批号20090316）、胸苷（批号1001182663）、肌苷（批号ZJ0620WA14）均购自中国惠兴生化试剂有限公司；葡萄糖（批号E1407051）对照品购自Sigma公司，葡萄糖醛酸（批号B1611057）对照品购自中国食品药品检定研究院。所有对照品的纯度均在98%以上。
乙腈、甲酸、甲醇均为色谱纯，购自Merck公司；其他试剂均为分析纯，购自南京化学试剂股份有限公司；水为Millipore超纯水。
蚕沙，产地为苏州、重庆、桐乡、大理、镇江、广西和河南，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为蚕蛾科昆虫家蚕蛾幼虫的干燥粪便。
2 方法与结果 2.1 黄酮类化学成分的分析与评价 2.1.1 供试品溶液制备将蚕沙样品粉碎，过筛（60目），精密称取粉末1 g置于100 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，回流提取30 min，过滤，滤渣加入甲醇50 mL，回流提取30 min，过滤，合并2次滤液，减压浓缩（45 ℃，-0.09 MPa）至约5 mL，置10 mL量瓶中，以甲醇定容，离心10 min（13 000 r·min-1），取上清液，即得。
2.1.2 混合对照品溶液制备精密称取紫云英苷、异槲皮苷、芦丁的对照品适量，置于10 mL量瓶中，加入约5 mL甲醇摇匀并超声（频率90 kHz，功率500 W）5 min，待其充分溶解，定容至刻度，得到质量浓度为167、206、119 μg·mL-1的紫云英苷、异槲皮苷、芦丁混合对照品母液，并稀释至紫云英苷质量浓度分别为27.83、13.415、2.783、1.3415、0.2783、0.13415、0.02783 μg·mL-1，异槲皮苷质量浓度分别为34.33、17.165、3.433、1.716 5、0.343 3、0.171 65、0.034 33 μg·mL-1，芦丁质量浓度分别为19.83、9.915、1.983、0.991 5、0.198 3、0.099 15、0.019 83 μg·mL-1的系列混合对照品溶液。
2.1.3 液相色谱-质谱条件色谱条件：采用AcquityTM UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~8 min，90%A→40%A；8~8.5 min，40%A→20%A），流速0.4 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量2 μL。质谱条件：检测方式为多反应监测（MRM），毛细管电压3.0 kV，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度550 ℃；脱溶剂气体积流量1 000 L·h-1，锥孔气流量50 L·h-1，碰撞气流量0.15 mL·min-1。测定的黄酮类成分主要质谱参数见表 1。样品色谱图见图 1。
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表 1 黄酮类成分质谱参数 Tab.1 Mass spectrometry parameters for flavonoids |
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图 1 芦丁、异槲皮苷和紫云英苷的UPLC-MS/MS色谱图 Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms of rutin, quercitrin and astragalin |
精密移取“2.1.2”项下不同质量浓度的混合对照品溶液，按照“2.1.3”项下条件分别测定，记录峰面积，以对照品质量浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归。在信噪比（S/N）为10时测得定量下限（LOQ）。结果（表 2）表明，所测3个黄酮类化学成分在一定的线性范围内线性关系良好（r2＞0.999），且具有较高的灵敏度。
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表 2 黄酮类成分回归方程、相关系数（R2）、线性范围及LOQ Tab.2 Regression equations, correlation coefficent(R2), linear ranges and LOQ of flavonoids |
精密吸取混合对照品溶液2 μL，按上述色谱条件连续进样6次，测定待测成分色谱峰峰面积并计算RSD。结果紫云英苷、异槲皮苷与芦丁峰面积的RSD分别为1.7%、2.1%、1.9%，表明其精密度良好。
2.1.6 重复性试验取苏州蚕沙样品6份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，依次进样，记录待测成分峰面积，计算含量并计算RSD。结果紫云英苷、异槲皮苷与芦丁平均含量分别为1.96、5.20、1.65 μg·g-1，RSD分别为1.3%、2.2%、1.5%，表明方法重复性良好。
2.1.7 稳定性试验取苏州蚕沙的供试品溶液，分别在0、4、8、12、18、24 h进行测定，记录峰面积，计算紫云英苷、异槲皮苷与芦丁3个成分的RSD分别为2.4%、1.7%、1.4%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。
2.1.8 加样回收率试验取已测知含量（分别含有紫云英苷、异槲皮苷与芦丁0.73、3.44、1.28 μg·g-1）的苏州蚕沙样品粉末6份，每份0.5 g，精密称定，分别按样品中待测成分含有量的的80%、100%、120%加入紫云英苷、异槲皮苷与芦丁混合对照品溶液（紫云英苷、异槲皮苷与芦丁质量浓度分别为0.361 5、1.72、0.64 μg·mL-1）0.8、1、1.2 mL各2份，按照“2.1.1”项下方法制备供试溶液后，在“2.1.3”项条件下进行测定，记录峰面积，计算加样回收率及RSD。结果平均加样回收率分别为101.0%、99.8%、99.6%，RSD为3.2%、1.1%、1.5%，表明方法测定结果准确度较高。
2.1.9 样品测定及结果分析取不同产地、不同龄期蚕沙样品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液并依次进行分析。由表 3各成分含量测定结果可看出，蚕沙黄酮类成分含量中异槲皮苷显著高于芦丁和紫云英苷，后两者在同一样品中含量相差不大。不同产地蚕沙黄酮类含量差别明显，其中重庆、大理产蚕沙显著高于其他产地，以重庆产地蚕沙最为明显；不同龄期蚕沙中黄酮类成分含量也呈现出一定差别，其总量随着龄期的增大而减少。
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表 3 不同样品中黄酮类成分的分析结果 Tab.3 Contents of flavonoids in different samples |
蚕沙粉碎，过60目筛，称取约1 g，置于100 mL锥形瓶中，以1 :50的料液比加入70%乙醇溶液50 mL，称量，室温静置1 h，超声（频率90 kHz，功率500 W）提取45 min，重新称量，以70%乙醇溶液补足减失的量，摇匀，取20 mL混悬液于50 mL离心管中，6 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液，13 000 r·min-1条件下再次离心10 min，取上清，过0.22 μm膜，得续滤液，即得。
2.2.2 混合对照品溶液制备精密称定常压干燥至恒重的1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）、荞麦碱的对照品适量，置于10 mL量瓶中，加入约5 mL甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为144 μg·mL-1和70 μg·mL-1的混合对照品母液，以甲醇稀释成1-脱氧野尻霉素质量浓度分别为72、18、3.6、1.8、0.36、0.18 μg·mL-1，荞麦碱质量浓度分别为35、17.5、8.75、1.75、0.875、0.175、0.087 5 μg·mL-1的系列混合对照品溶液。
2.2.3 液相色谱-质谱条件色谱条件：采用ACQUITYTM UPLC BEH Amide色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相A为5 mmol·L-1甲酸铵、5 mmol·L-1乙酸铵、0.2%甲酸水溶液，流动相B为1 mmol·L-1甲酸铵、1 mmol·L-1乙酸铵、0.2%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱（0~3 min，10%A；3~9 min，10%A→18%A；9~15 min，18%A→20%A；15~16 min，20%A→46%A；16~18 min，46%A），流速0.4 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量2 μL。质谱条件：离子化模式为ESI+，检测方式为多反应监测（MRM），毛细管电压3.0 kV，离子源温度120 ℃，脱溶剂气流量和温度分别为1 000 L·h-1和550 ℃，碰撞、锥孔气流量分别为0.15 mL·min-1、20 L·h-1。各成分具体质谱参数见表 4，样品色谱峰见图 2。
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表 4 生物碱类成分MRM模式参数 Tab.4 MRM parameters for alkaloids |
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图 2 1-脱氧野尻霉素和荞麦碱的UPLC-MS/MS色谱图 Fig.2 UPLC-MS/MS chromatogram of DNJ and fagomine |
取系列混合对照品溶液，按“2.2.3”项下色谱及质谱条件进样测定，以待测物峰面积Y为纵坐标，对照品溶液浓度X（μg·mL-1）为横坐标，进行线性回归分析，得到线性回归方程（表 5）。LOD、LOQ分别为及时的浓度。1-脱氧野尻霉素、荞麦碱的LOD（S/N=3）分别为0.007 8 μg·mL-1和0.037μg·mL-1，LOQ（S/N=10）分别为0.024 μg·mL-1和0.140μg·mL-1。
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表 5 生物碱类成分回归方程、相关系数（R2）及线性范围 Tab.5 Regression equations, correlation coefficent(R2)and linear ranges of alkaloids |
取混合对照品溶液，在上述色谱及质谱条件下连续重复进样6次，记录1-脱氧野尻霉素、荞麦碱峰面积并计算其RSD，结果均为1.3%，表明其精密度良好。
2.2.6 重复性试验取样品（镇江五龄蚕沙）6份，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液并分别进样测定，计算其样品中1-脱氧野尻霉素、荞麦碱平均含量分别为0.38、0.45 mg·g-1，RSD均为2.1%，表明方法重复性良好。
2.2.7 稳定性试验取样品（镇江五龄蚕沙），按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、18、24 h时各进样1次，求1-脱氧野尻霉素、荞麦碱峰面积的RSD，结果分别为2.8%和2.2%。
2.2.8 加样回收率试验称取已知含量的样品（镇江五龄蚕沙）6份，每份0.5 g，分别按样品中待测成分含有量的80%、100%、120%加入混合对照品溶液（1-脱氧野尻霉素、荞麦碱质量浓度分别为0.47、0.315 μg·mL-1）0.8、1、1.2 mL各2份，按“2.2.1”项下方法制备供试溶液，并进行分析，计算其回收率与RSD。结果1-脱氧野尻霉素、荞麦碱平均加样回收率分别为92.4%和98.1%，RSD分别为2.2%和2.0%。
2.2.9 样品测定结果及分析取不同产地、不同龄期蚕沙样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液并依次进行分析。结果各蚕沙样品的1-脱氧野尻霉素、荞麦碱含量见表 6，蚕沙中生物碱含量以江浙一带居高，在所选样本中苏州蚕沙生物碱含量最高，镇江次之，广西蚕沙生物碱含量显著低于其他产地；此外，三龄蚕沙到五龄蚕沙，生物碱含量递增，其主要体现在1-脱氧野尻霉素含量的增高。
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表 6 不同产地、不同龄期蚕沙中生物碱类成分含量 Tab.6 Contents of alkaloids in silkworm excrement from different habitats and at different various instars |
称取样品粉末（过60目筛）1 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入水50 mL，称量，室温静置1 h，超声（频率90 kHz，功率500 W）提取30 min，称量，以水补足失量，摇匀，过滤，取续滤液离心（13 000 r·min-1）10 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后，取续滤液，即得。
2.3.2 对照品溶液制备称取干燥至恒重的对照品适量，以超纯水配制成γ-氨基丁酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-α-丙氨酸、L-瓜氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、鸟苷、L-缬氨酸、L-脯氨酸、胞苷、腺嘌呤、L-赖氨酸、胸苷、肌苷质量浓度分别为0.101、0.192、0.067、0.220、0.162、0.144、0.284、0.129、0.303、0.151、0.150、0.116、0.174、0.118、0.126、0.096、0.114、0.116、0.203 mg·mL-1的混合对照品储备液，加水分别稀释2、10、20、100、200、1 000倍，得到系列混合对照品溶液。
2.3.3 液相色谱-质谱条件色谱条件：采用ACQUITY TM UPLC BEH Amide色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相A为5 mmol·L-1甲酸铵、5 mmol·L-1乙酸铵、0.2%甲酸水溶液，流动相B为1 mmol·L-1甲酸铵、1 mmol·L-1乙酸铵、0.2%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱（0~3 min，10%A；3~9 min，10%A→18%A；9~15 min，18%A→20%A；15~16 min，20%A→46%A；16~18 min，46%A），流速0.4 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量2 μL。质谱条件：离子化模式为ESI+，检测方式为多反应监测（MRM），毛细管电压3.0 kV，离子源温度120 ℃，脱溶剂气流量和温度分别为1 000 L·h-1和550 ℃，碰撞、锥孔气流量分别为0.15 mL·min-1、20 L·h-1。各成分具体质谱参数参考相关文献[2]，典型样品色谱图见图 3。
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图 3 核苷类和氨基酸类成分UPLC-MS/MS色谱图 Fig.3 UPLC-MS/MS chromatogram of nucleosides and amino acids |
取系列混合对照品溶液，按上述条件进样测定，以各待测物峰面积Y为纵坐标，对照品溶液质量浓度X（μg·mL-1）为横坐标，进行线性回归分析。S/N=10时测定LOQ。结果见表 7。
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表 7 19个氨基酸及核苷类成分的回归方程、相关系数（r2）、线性范围和LOQ Tab.7 Regression regressions, correlation coefficent(r2), linear ranges and LOQ of 19 nucleosides and amino acids |
具体操作步骤同“2.2.5”，“2.2.6”、“2.2.7”、“2.2.8”项，结果见表 8。由表 8可知，精密度、稳定性、重复性及加样回收率均在要求范围内，说明本方法可行，测定结果准确可靠。
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表 8 各成分的精密度、稳定性、重复性及回收率试验结果 Tab.8 The testing results of precision, stability and recovery of the analytes |
取不同产地、不同龄期蚕沙样品，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液并依次进行分析，核苷类和氨基酸类成分含量测定结果见表 9。由各成分含量测定结果可看出，广西蚕沙所含核苷类、氨基酸类成分种类最少，大理和河南蚕沙中均未检测到L-赖氨酸；苏州蚕沙中核苷类、氨基酸类成分总含量明显高于其他，广西蚕沙中核苷类、氨基酸类成分总含量明显低于其他，前者含量约为后者的5倍；蚕沙中含量较高的氨基酸分别为L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-α-丙氨酸、L-谷氨酸和L-苏氨酸，且该4个氨基酸含量均随着龄期呈递增趋势。此外，发现镇江四龄蚕沙中肌苷含量明显高于其他样品。
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表 9 核苷、氨基酸测定结果（μg·g-1） Tab.9 Contents of nucleosides and amino acids |
取样品粉末（过60目筛）约1 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，准确加入80%乙醇40 mL，静置2 h后，室温超声（频率90 kHz，功率500 W）提取30 min，再70 ℃水浴1 h，趁热抽滤，将滤渣和滤纸用热80%乙醇约10 mL洗2~3次，放入锥形瓶中，滤渣连同滤纸置于锥形瓶中烘干，精密加入超纯水40 mL，称量，室温超声（频率90 kHz，功率500 W）30 min，100 ℃水浴1 h，放冷，以超纯水补足减失的量，摇匀，离心10 min（13 000 r min-1），取上清，即得。
2.4.2 对照品储备液制备精密称定干燥至恒重的葡萄糖对照品26.26 mg及葡萄糖醛酸对照品32.95 mg，分别置于100 mL量瓶中，加水溶解并定容，混匀，即得质量浓度为262.6 μg mL-1葡萄糖对照品储备液和329.5 μg mL-1葡萄糖醛酸对照品储备液。
2.4.3 线性关系考察中性多糖：精密量取上述葡萄糖对照品储备液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置25 mL具塞玻璃试管中，加水至1.0 mL，摇匀，精密加入5%的苯酚溶液2 mL，振荡摇匀，迅速加入浓硫酸7 mL，混匀，沸水浴20 min，冰水浴冷却5 min后，490 nm处测吸收度。扣除空白后，以质量浓度X（mg·mL-1）为横坐标，吸收度Y为纵坐标，作标准曲线，求得相应回归方程：
| $ Y = 3.642{\rm{ }}5X - 0.002{\rm{ }}7\;\;\;{R^2} = 0.999{\rm{ }}4 $ |
线性范围为0.026 26~0.262 6 mg·mL-1。
酸性多糖：精密量取上述葡萄糖醛酸对照品储备液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置25 mL具塞玻璃试管中，加水至1.0 mL，摇匀，精密加入12.5 mmol·L-1四硼酸钠硫酸溶液5.0 mL（冰浴中），充分混匀，沸水浴10 min，精密加入0.125%咔唑无水乙醇溶液0.2 mL，混匀，置沸水浴中加热15 min，冰水浴冷却5 min后，于512 nm处测吸收度。扣除空白后，以质量浓度X（mg·mL-1）为横坐标，吸收度Y为纵坐标，作标准曲线，求得相应回归方程：
| $ Y = 3.605X + 0.008{\rm{ }}2\;\;\;r = 0.999{\rm{ }}6 $ |
线性范围为0.032 95-0.329 5 mg·mL-1。
2.4.4 精密度、重复性及稳定性试验精密量取葡萄糖对照品储备液和葡萄糖醛酸对照品储备液各0.2 mL，分别按“2.4.3”项下测定方法操作，连续测定6次吸收度，计算中性多糖和酸性多糖精密度RSD分别为0.24%和0.16%，说明方法精密度良好。精密称取大理蚕沙样品粉末6份各1 g，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，精密量取供试品溶液0.2 mL，按“2.4.3”项下自“分别置25 mL具塞玻璃试管中，加水至1.0 mL，摇匀，精密加入5%的苯酚溶液2 mL”起操作，于490 nm处测定吸收度并计算中性多糖含量；精密量取供试品溶液0.2 mL，按“2.4.3”项下自“分别置25 mL具塞玻璃试管中，加水至1.0 mL，摇匀，精密加入12.5 mmol·L-1四硼酸钠硫酸溶液5.0 mL（冰浴中）”起操作，于512 nm处测定吸收度并计算酸性多糖含量，结果中性多糖和酸性多糖平均含量分别为4.51%和4.05%，RSD为1.5%和1.6%，表明该方法重复性良好。取大理蚕沙供试品溶液3份，分别按“2.4.3”项下中性多糖或酸性多糖的测定方法操作，冰水浴冷却5 min显色完成后，分别在0、20、40、60、90、120 min测定吸收度。3份供试品溶液的中性多糖在120 min内吸收度的RSD分别为0.14%、0.21%和0.18%，酸性多糖吸收度的RSD分别为0.34%、0.31%和0.29%，结果表明供试品显色后溶液在120 min内稳定。
2.4.5 加样回收率试验精密称取大理蚕沙样品粉末6份，每份0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入与样品中中性多糖等量的葡萄糖对照品溶液，依法测定，得中性多糖平均回收率为97.9%，RSD为2.6%。另取大理蚕沙样品粉6份，每份0.5 g，精密加入与样品中酸性多糖等量的葡萄糖醛酸对照品溶液，依法测定，得酸性多糖的平均回收率为103.7%，RSD为2.8%，表明本方法测定结果准确度良好。
2.4.6 样品测定结果及分析取蚕沙样品，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.4”项下方法测定中性多糖和酸性多糖含量，结果见表 10。由表 10可知，蚕沙中的可溶性多糖含量约为9%，其中苏州、桐乡、镇江产蚕沙多糖含量相似，大理产蚕沙多糖含量最高。
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表 10 不同产地、不同龄期蚕沙中中性多糖和酸性多糖成分含量分析 Tab.10 Contents of neutral polysaccharides and acidic polysaccharides in silkworm excrement from different habitats and at different various instars |
准确称取干燥蚕沙粉末（过60目筛）1 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，锥形瓶外部用锡箔纸包裹避光。加入2 mL水软化蚕沙15 min，再加入无水乙醇-丙酮（1 :2）24 mL，超声（频率90 kHz，功率500 W）提取38 min，抽滤，得叶绿素提取液。实验过程中确保环境昏暗、避光。
2.5.2 叶绿素的含量测定方法将叶绿素提取液200 μL加入96孔板，采用酶标仪在645、663 nm处进行吸收度（A）检测，按Amon公式计算蚕沙中叶绿素含量。叶绿素a质量浓度（mg·L-1）：Ca=12.7 A663-2.69A645；叶绿素b质量浓度（mg·L-1）：Cb=22.9A645-4.68A663；叶绿素总质量浓度（mg·L-1）：C总=Ca+Cb；叶绿素含量（mg·g-1）=C总×提取液体积÷样品质量。
2.5.3 精密度、重复性、稳定性试验取大理蚕沙叶绿素提取液200 μL，按照“2.5.2”项下方法，连续测定6次吸收度，计算其RSD为1.9%，说明方法精密度良好。精密称取大理蚕沙样品粉末6份各1 g，按上述方法进行提取、测定，并计算叶绿素含量，得大理蚕沙叶绿素总含量平均值为1.66 mg·g-1，RSD为2.2%，表明方法重复性良好。取大理蚕沙叶绿素提取液3份，按“2.5.2”项下方法，分别在0、20、40、60、80、120 min测定吸收度，3份提取液在120 min内吸收度的RSD分别为0.24%、0.31%和0.18%，结果表明提取液在120 min内稳定。
2.5.4 样品测定结果及分析按照本研究所采用的方法，对于不同产地、不同龄期蚕沙中叶绿素的含量进行测定，结果见表 11，所有蚕沙样品中叶绿素a的含量均高于叶绿素b，二者含量差别明显；镇江三龄蚕沙所含叶绿素最为丰富；广西蚕沙叶绿素含量显著低于其他各产地；大理、桐乡、重庆蚕沙叶绿素含量较为相似，叶绿素a和叶绿素b的含量均随着龄期的增加而逐渐减少。
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表 11 不同产地、不同龄期蚕沙中叶绿素类成分含量 Tab.11 Contenst of chlorophyll in silkworm excrement from different habitats and at different various instars |
资源的利用价值在于其可利用物质的多用性和多宜性特点[4]。本研究表明，不同产地、不同龄期蚕沙中所含有的黄酮类、生物碱类、核苷类、氨基酸类、可溶性多糖类、叶绿素类化学成分的含量差别明显，据此可依据各类资源性化学成分的潜在利用价值进行产业化开发，以提高蚕沙资源的利用效率。黄酮类成分是自然界中重要的生物活性成分，也是多种天然药物的功效物质基础，其中芦丁在自然界中分布广泛，具有抗炎作用、维生素P（VP）样作用、抗氧化作用、保护胃肠黏膜、镇痛、脏器缺血损伤保护作用、抗癌等多种生物活性[5]；异槲皮苷具有抗抑郁[6]，改善血糖[7]，抑制成骨细胞分化[8]等作用；紫云英苷具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。蚕沙中的黄酮类成分含量受地域影响较为明显，其中大理蚕沙黄酮类成分含量约为河南蚕沙的25倍，此外，龄期也影响着蚕沙中黄酮类成分的含量，具体表现为三龄黄酮类成分含量 > 四龄黄酮类成分含量 > 五龄黄酮类成分含量。
1-脱氧野尻霉素为典型的多羟基生物碱。研究表明，1-脱氧野尻霉素可显著改善餐后血糖，延缓糖尿病的病程，同时对于肥胖症及病毒感染等病症具有显著功效[9]。1-脱氧野尻霉素主要来源为微生物来源与植物来源，其中植物来源主要为桑叶，桑叶中1-脱氧野尻霉素含量约占干重的0.4%。本实验测得的蚕沙中生物碱含量达到0.1%，其中以江浙一带蚕沙所含生物碱居高，且随着龄期的增加而增加，蚕沙中生物碱含量虽不及桑叶中含量高，但由于蚕沙具有产量高、价格低廉的优点，值得对蚕沙中的生物碱类成分进行深入研究。
核苷类成分是细胞维持生命状态的基本元素，可直接参与DNA代谢过程，具有抗病毒，抗肿瘤，免疫调节，基因治疗，抗血小板凝集等多种生物活性[10-13]。氨基酸为蛋白质的基本结构和生物代谢过程的重要中间体，是机体必须的营养成分。本研究显示蚕沙中核苷类、氨基酸类成分总含量达到0.2%，不同产地之间含量差异显著，其中江苏产蚕沙以苏州为代表，普遍含量较高。对于含量较高的L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-α-丙氨酸、L-谷氨酸和L-苏氨酸，在不同产地中差异尤为明显。L-亮氨酸是一种最有效的支链氨基酸，可修复肌肉，控制血糖，高效供能；L-缬氨酸为必需氨基酸，当其不足时，可使大脑中枢神经系统发生功能紊乱，产生共济失调和四肢震颤；L-谷氨酸为酸性氨基酸，本身可用作药物，参与脑内各种代谢，促进氧化进程；L-苏氨酸常用作饲料添加剂，可起到促进生长，改善肉质，降低成本的作用。
越来越多的研究证明多糖具有多方面的生物活性和功能，尤其是对于机体免疫功能的调节作用，从多种动植物中提取的多糖其主要生物活性包括抗肿瘤活性，抗病毒作用，降血糖作用，抗炎作用及抗补体等作用[14]。本研究显示，蚕沙中的可溶性多糖含量约为9%，其中苏州、桐乡、镇江产蚕沙多糖含量相似，大理蚕沙多糖含量最高。对比本课题组前期关于桑叶中可溶性多糖类成分的含量测定结果0.69%，说明多糖类成分在家蚕体内出现了富集。蚕沙中所含的多糖多为果胶类物质，在医药、食品添加及美容保健方面应用广泛，因此可以蚕沙为主要原料对其进行提取制备，并逐步使其产业化，有效降低成本。
叶绿素是一种重要的天然色素，在自然界中存在广泛，其降解产物和衍生后的产物在食品、医药和化工领域均有广泛的应用[15]，目前以蚕沙提取糊状叶绿素制得的生血宁片已投入市场[16]。本实验对来自桑蚕资源较为丰富的七大产区蚕沙中的叶绿素成分进行分析测定，结果发现，蚕沙中的叶绿素含量总体较高，约为0.2%，与文献报道[3]相似，此外，蚕沙中叶绿素含量与家蚕所处龄期密切相关，其中三龄蚕沙中叶绿素含量最高，推测其原因为三龄家蚕尚处于幼蚕期，体内各器官发育不成熟，对于桑叶的消化吸收不完全，导致体外排出增多，最终造成蚕沙中叶绿素成分含量较高，提示以蚕沙为原料开发叶绿素类相关产品发展空间广阔，三龄蚕沙或将成为首选。
综上所述，本研究通过对不同产地、不同龄期蚕沙中多类型资源性化学成分的分析与评价，明确了蚕沙中的资源性化学成分组成与特点，为蚕沙资源价值发现及其开发利用提供了科学依据和参考。
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