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  药物分析杂志   2019, Vol. 39 Issue (4): 608-614.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.04.05
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张艳丽, 杨雁芸, 白志尧, 曹彦刚, 孙亚萍, 刘通, 克迎迎, 吴亚. UPLC-MS/MS同时测定熟地黄中8个核苷类成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(4): 608-614. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.04.05.
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ZHANG Yan-li, YANG Yan-yun, BAI Zhi-yao, CAO Yan-gang, SUN Ya-ping, LIU Tong, KE Ying-ying, WU Ya. Simultaneous determination of eight nucleosides in Rehmanniae Radix Praeparata by UPLC-MS/MS[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39(4): 608-614. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.04.05.
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基金项目

中央引导地方科技发展专项:河南道地大宗药材种质评价及集约化种植与示范(14104349);河南省重大科技专项:地黄、山药、牛膝豫产道地药材品质保障关键技术与品质特色研究(171100310500);国家重点研发计划:地黄特色中药材产业链关键技术研究(2017YFC1702800);河南中医药大学博士启动基金(BSJJ2014-16)

第一作者

张艳丽, Tel:(0371)65676656;E-mail:zyl2013hnzy@163.com

文章历史

收稿日期:2018-04-03
UPLC-MS/MS同时测定熟地黄中8个核苷类成分的含量
张艳丽 1,2, 杨雁芸 1,2, 白志尧 1,2, 曹彦刚 1,2, 孙亚萍 1,2, 刘通 1,2, 克迎迎 1,2, 吴亚 1    
1. 河南中医药大学, 郑州 450046;
2. 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心, 郑州 450046
摘要目的:建立超高效液相色谱-三重四极杆质谱法(UPLC-MS/MS法)同时测定熟地黄中鸟苷、肌苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷、胞苷、腺嘌呤、次黄嘌呤8个核苷的含量。方法:采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色谱柱,以0.1%甲酸溶液-甲醇为流动相梯度洗脱,流速0.2 mL·min-1,柱温30℃,进样量2 μL,ESI+,多反应监测(MRM)对熟地黄饮片中8个核苷类成分进行含量测定。结果:所测8个核苷类成分在测定质量浓度范围内线性关系良好(R2>0.996 0),平均加样回收率为98.6%~102.0%,RSD为1.3%~2.9%。6批样品中鸟苷、肌苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷、胞苷、腺嘌呤、次黄嘌呤的含量范围分别为0.045~71.838、3.220~11.253、84.613~102.508、1.516~4.893、6.426~68.003、0.138~17.437、0.423~1.953、0.142~1.216 μg·g-1结论:该方法适用于同时测定熟地黄饮片中鸟苷、肌苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷、胞苷、腺嘌呤、次黄嘌呤8个核苷类成分含量,可用于熟地黄饮片的质量控制。
关键词熟地黄    核苷    鸟苷    肌苷    尿苷    尿嘧啶    腺苷    胞苷    腺嘌呤    次黄嘌呤    含量测定    质量控制    超高效液相色谱-串联质谱    
Simultaneous determination of eight nucleosides in Rehmanniae Radix Praeparata by UPLC-MS/MS
ZHANG Yan-li1,2, YANG Yan-yun1,2, BAI Zhi-yao1,2, CAO Yan-gang1,2, SUN Ya-ping1,2, LIU Tong1,2, KE Ying-ying1,2, WU Ya1    
1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China;
2. Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province, Zhengzhou 450046, China
Abstract: Objective: To establish an UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of guanosine, inosine, uridine, uracil, adenosine, cytidine, adenine and hypoxanthine in Rehmanniae Radix Praeparata.Methods: Waters BEH C18 column (2.1 mm×50 mm, 1.7 μm) with gradient elution of 0.1% formic acid and methanol was adopted. The flow rate was 0.2 mL·min-1 and the column temperature was 30℃. Eight nucleosides were detected in positive electrospray ionization mode and multiple reaction monitoring (MRM).Results: Eight nucleosides in Rehmanniae Radix Praeparata showed good linear relationships within their own ranges (R2>0.996 0), whose average recoveries were 98.6%-102.0%, with the RSDs of 1.3%-2.9%. The contents of eight nucleosides in 6 batches of samples were 0.045-71.838 (guanosine), 3.220-11.253 (inosine), 84.613-102.508 (uridine), 1.516-4.893 (uracil), 6.426-68.003 (adenosine), 0.138-17.437 (cytidine), 0.423-1.953 (adenine) and 0.142-1.216 (hypoxanthine) μg·g-1, respectively.Conclusion: The method for the simultaneous determination of the eight nucleosides can be used for qualitative and quantitative analysis of nucleosides in Rehmanniae Radix Praeparata.
Keywords: Rehmanniae Radix Praeparata    nucleosides    guanosine    inosine    uridine    uracil    adenosine    cytidine    adenine    hypoxanthine    content determination    quality control    ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)    

熟地黄由玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的干燥块根经加工炮制而成,地黄主产于为河南温县、武陟等地,为我国著名的“四大怀药”之一,在陕西、河北等地也有野生和栽培[1]。化学研究表明,地黄中主要含有环烯醚萜、苯乙醇苷、紫罗兰酮类、木脂素类、核苷酸类、三萜类等化学成分[2-6]。地黄经炮制成熟地黄后,寒性转为温性,苦味转为甘味,具有滋阴补血、益精填髓之功效[7]。现代药理学研究表明,地黄具有很好的降血糖[8],抗氧化[9],抗胃溃疡[10],抗衰老,增强记忆力[11],保肝等作用。近期研究发现,天然的核苷类物质与生物生命活动密不可分,被认为是滋补类中药共有的化学成分,具有广泛的生理活性,如食源性肌苷、鸟苷、尿苷等能够减缓老年性大脑退化和提高记忆力[12],腺苷可用于治疗心动过速、心律失常等疾病[13],肌苷能够治疗各种急慢性肝脏疾病,作用于中心神经系统刺激轴突生长等[14]。《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版仅规定熟地黄药材按照干燥品计算,含毛蕊花糖苷不得少于0.02%。基于中药的整体作用及多组分、多靶点的用药特点,单一指标性成分不能准确反映中药材的质量,因此本实验采用UPLC-MS/MS法测定熟地黄中鸟苷、肌苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷、胞苷、腺嘌呤、次黄嘌呤8个核苷类成分的含量,为提升熟地黄及其制剂的质控标准提供参考和依据。

1 仪器与材料 1.1 仪器

Waters公司ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪[配ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)];宁波新芝生物科技股份有限公司SB-5200D型数控超声波清洗仪;Mettler Toledo公司METTLER AB135-S型十万分之一电子分析天平;江苏新康医疗器械有限公司XK80-A型涡旋混匀仪;Eppendorf公司CENRIFUGE 5810R高速冷冻离心机。

1.2 材料

鸟苷(批号AJ0609NA14)、肌苷(批号TJ0623XA13)、尿苷(批号TM0313XA13)、尿嘧啶(批号T14A8X33880)、腺苷(批号Z23S7J21814)、胞苷(批号D12M6H2)、腺嘌呤(批号X18N6M6005)和次黄嘌呤(批号TM0313XA13)的对照品均购自上海源叶生物科技有限公司,经面积归一法测定,纯度均大于98%。Fisher公司甲醇、甲酸为色谱级,实验用水为Millipore公司Milli-Q超纯水。6批熟地黄样品,编号SHUDH-1(批号160302,河南青山药业有限公司)、SHUDH-2(批号160903,郑州东升大药房)、SHUDH-3(批号171003-1,郑州圣汇大药房有限公司)、SHUDH-4(批号170901,河南张仲景大药房)、SHUDH-5(批号160802,北京同仁堂大药房)、SHUDH-6(批号16060601,安徽协和成药业饮片有限公司),购买于郑州各大药房,经河南中医药大学董诚明教授鉴定均为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)的炮制加工品。样本存放于河南中医药大学药学院中药化学研究室。

2 方法与结果 2.1 对照品溶液的制备

取鸟苷、肌苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷、胞苷、腺嘌呤和次黄嘌呤的对照品适量,精密称定后加入10%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,即得含鸟苷69.30 μg·mL-1,肌苷31.49 μg·mL-1,尿苷76.92 μg·mL-1,尿嘧啶79.51 μg·mL-1,腺苷103.53 μg·mL-1,胞苷79.87 μg·mL-1,腺嘌呤84.61 μg·mL-1和次黄嘌呤98.29 μg·mL-1的单一对照品溶液,置于4 ℃冰箱储存备用。

2.2 供试品溶液的制备

取熟地黄饮片适量,置于鼓风干燥箱中50 ℃干燥0.5 h,粉碎,过3号筛,得熟地黄饮片样品粉末。取样品粉末1 g,精密称定,置于50 mL具塞锥形瓶中,精密加入10%甲醇溶液10 mL,称量,超声提取(250 W,40 kHz)30 min,放冷至室温,用10%甲醇溶液补足减失的量,12 000 r·min-1离心10 min,取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液,置于4 ℃冰箱储存备用。

2.3 色谱条件

色谱柱:Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0~4 min,2%B→5%B;4~8 min,5%B→8%B;8~10 min,8%B→10%B;10~11 min,10%B→2%B);流速:0.2 mL·min-1;柱温:30 ℃;进样量:2 μL。

2.4 质谱条件

采用电喷雾电离源(ESI),正离子多反应检测(MRM)模式。毛细管电压:3.5 kV;离子源温度150 ℃;脱溶剂气N2,脱溶剂气流量300 L·h-1;脱溶剂气温度:300 ℃;雾化器压力:3.0 V。8个核苷类成分在MRM模式下的色谱保留时间和具体质谱条件参数见表 1,MRM离子流图见图 1

表 1 8个核苷类成分的MS参数 Tab.1 MS parameters of eight nucleosides

1.鸟苷(guanosine)2.肌苷(inosine)3.尿苷(uridine)4.尿嘧啶苷(uracil)5.腺苷(adenosine)6.胞苷(cytidine)7.腺嘌呤(adenine)8.次黄嘌呤(hypoxanthine) 图 1 8个核苷类成分的MRM色谱 Fig.1 MRM chromatograms of eight nucleosides
2.5 方法学考察 2.5.1 线性关系考察及检出下限、定量下限测定

精密吸取“2.1”项下的各对照品溶液适量,置同一10 mL量瓶中,加10%甲醇溶液定容至刻度,即得混合对照品母液,用10%甲醇溶液逐级稀释配制6个浓度点的混合对照品溶液,按“2.3”和“2.4”项下的方法进样分析,以对照品的质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标,对照品的峰面积Y为纵坐标,进行线性回归,得回归方程。精密吸取混合对照品溶液进行梯度稀释,按照信噪比为3和10分别对应的质量浓度确定各成分的检测下限(LOD)和定量下限(LOQ)。8个核苷类成分的线性回归方程、相关系数、线性范围、LOD及LOQ见表 2。结果表明,8个核苷类成分在各自浓度范围内线性关系良好(R2≥0.996 2),LOD为0.021~4.976 ng·mL-1,LOQ为0.086~15.602 ng·mL-1

表 2 线性方程、线性范围、相关系数、LOD和LOQ Tab.2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients, LOD and LOQ
2.5.2 精密度试验

取同一混合对照品溶液,按“2.3”和“2.4”项下色谱条件连续进样6次,分别记录鸟苷、肌苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷、胞苷、腺嘌呤、次黄嘌呤的峰面积,结果8个核苷类成分峰面积的RSD为0.86%~2.6%,表明实验所建立的方法有较好的精密度。

2.5.3 重复性试验

按“2.2”项下方法制备供试品溶液(样品SHUDH-1)6份,分别进样分析,测得鸟苷、肌苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷、胞苷、腺嘌呤、次黄嘌呤8个核苷类成分的平均含量分别为0.044、3.986、84.65、3.587、6.467、0.130、0.539、1.206 μg·g-1,RSD分别为1.7%、2.3%、2.1%、1.2%、2.1%、1.8%、1.9%、2.1%,表明实验所建立的方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验

取编号为SHUDH-1的药材饮片样品,按“2.2”项下的方法处理,将所得供试品溶液于0、2、4、6、8和12 h进样测定,结果8个核苷类成分含量的RSD为1.6%~2.4%,表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5.5 加样回收率试验

取已知含量的熟地黄饮片样品(样品SHUDH-1)6份,约0.5 g,分别精密加入高、中、低3个浓度的混合对照品溶液,按“2.2”、“2.3”及“2.4”项下方法进行处理和分析,测定8个核苷类成分的量,计算各成分的回收率及RSD。结果在3个浓度添加水平下,8个核苷类成分的加样回收率为98.6%~102.0%,RSD均小于3.0%,见表 3,表明所建立的方法的准确度较好,能满足熟地黄饮片中8个核苷类成分的测定要求。

表 3 8个核苷类成分的回收率及RSD(n=6) Tab.3 Recoveries and RSDs of the eight nucleosides
2.6 样品测定

取各批次的熟地黄饮片,分别按“2.2”项下的方法制备供试品溶液,按“2.3”和“2.4”项下的色谱和质谱条件检测分析,计算各批次熟地黄饮片中8个核苷类成分的含量(以干燥品计),结果见表 4

表 4 6批样品中8个核苷类成分含量(μg·g-1n=3) Tab.4 Contents of the eight nucleosides in six batches of samples
3 讨论 3.1 供试品溶液制备方法的确定

本实验从药材粉末粒径(过2、3、4号筛)、提取溶剂(水、0.1%甲酸水、10%甲醇水、30%甲醇水、50%甲醇水)、溶剂用量(5、10、15、25、50 mL)、提取时间(10、20、30、40、50、60 min)等方面考察了熟地黄回流提取和超声提取方法,最终确定了“2.2”项下的供试品制备方法,此法简便,适合批量样本的操作。

3.2 色谱条件的选择

在优化色谱条件时,实验选用不同的流动相组成(甲醇-水、0.1%甲酸水-甲醇、乙腈-水)进行优化,实验结果显示以0.1%甲酸水-甲醇为流动相进行梯度洗脱时,分离时间短,峰形对称,检测灵敏度高。

3.3 小结

熟地黄为地黄加工炮制而得,补血滋阴,益精填髓,为常用的滋补类中药。核苷类成分是生物细胞维持生命的重要物质,参与代谢,为滋补类中药共有的化学成分。文献报道的熟地黄中核苷类成分的含量测定主要采用高效液相法[15-16],分析时间长,操作烦琐,测定所需样品量大,本文采用分离效果好,特异性强,灵敏度高,准确度高,重现性好的UPLC-MS/MS法可同时测定熟地黄中鸟苷、肌苷、尿苷、尿嘧啶、腺苷、胞苷、腺嘌呤和次黄嘌呤8个核苷类成分的含量,结果表明不同厂家熟地黄饮片中8个核苷含量差异较大,这可能与药材生长气候条件、土壤情况及炮制加工方法等多种因素有关。本文所建立的方法很大程度上提高了分析效率,15 min内就能够完成检测工作,有利于完善熟地黄饮片的质量标准。

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