2019, Vol. 39 
2. 中国药科大学药物分析教研室, 南京 210009;
3. 南京工业大学海外教育学院, 南京 211800;
4. 国家药典委员会, 北京 100061
2. Department of Pharmaceutical Analysis, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China;
3. College of Overseas Education, Nanjing Tech University, Nanjing 211800, China;
4. China Pharmacopeia Commission, Beijing 100061, China
蔗糖（sucrose）是天然的非还原性二糖，在甘蔗和甜菜中含量最为丰富，由一分子α-D-葡萄糖和一分子β-D-果糖失去一分子水以α-1，2糖苷键相连组成（如图 1），有旋光性，但无变旋现象[1]。蔗糖在医药领域是传统的药用辅料，常作为赋形剂、矫味剂、黏合剂等应用于口服糖浆剂、颗粒剂及注射剂等药品的生产中，以增加药物稳定性或改善口味[2]。蔗糖在《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2015年版[3]、EP 9.0[4]3664、USP 41-NF 36[5]5626及JP 17[6]中均有收载，但均未对其含量和有关物质进行检查控制。
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图 1 果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖分子结构式 Fig.1 Chemical structures of fructose, glucose, sucrose and raffinose |
蔗糖分子极性较强，因结构中缺乏生色官能团，紫外吸收较弱，无法采用常用的反相液相色谱-紫外检测器进行准确的分析。目前，国内外文献关于蔗糖的分析测定主要采用HPLC-RID法[1, 7-10]、HPLC-ELSD法[2, 11-12]、离子色谱法[13]与质谱法[14]。但在实际应用过程中发现，HPLC-ELSD法存在基线漂移，重现性差，线性范围窄；HPLC-RID法易受环境影响，耐用性不佳等；离子色谱-脉冲安培检测器法和质谱法仪器使用成本较高，仪器对实验人员的要求较高，不利于应用及推广。
电喷雾检测器（charged aerosol detector，CAD）是一种原理新颖，灵敏度高，重现性好的通用型检测器。它基于雾化气溶胶的原理，从液相系统流出的洗脱液经雾化后形成颗粒，经过干燥后与带电氮气碰撞，将电荷转移至分析物颗粒表面，最后通过静电计测定分析物表面的电荷量[15-16]。目前，电喷雾检测器法已被国外药典收录。例如EP 9.0[4]2560对钆布醇有关物质的检测以及USP 41-NF 36[5]1191对脱氧胆酸含量的测定，均采用液相色谱-CAD法。药典的收载和应用促进了CAD的推广。
本研究建立了蔗糖及其有关物质含量的HPLC-CAD测定法，该法专属性强，分离效果好，受环境影响小，经济耐用性好，明显优于国家药典委员会公示的蔗糖标准中采用方法[20]，可更加准确有效地控制蔗糖的质量，拟推荐用于《中国药典》2020年版蔗糖标准。
1 材料 1.1 仪器Dionex UltiMate 3000高效液相色谱仪、Dionex Corona Veo电喷雾检测器和Dionex Chromeleon 7.0色谱工作站（Thermo Fisher Scientific公司）；氮气发生器（毕克气体仪器贸易有限公司）；Bransonic 3510E-MT超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）；恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；XS205型、XSE205型电子天平（梅特勒-托利多公司）。
1.2 样品与试剂蔗糖样品：南京化学试剂有限公司，批号161122043G、170103007D、160214301D；南京蔗糖厂，批号20151214-069）。对照品：D-（+）-蔗糖（批号ES4IM-MC），购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；D-（-）-果糖（批号DE7PM-DM）、D-（+）-葡萄糖（批号TRTHE-PK），均购自东京化成株式会社；D-（+）-五水棉子糖（批号WXBC3743V），购自SIGMA试剂公司。实验用水为超纯水（Millipore超纯水机自制）；乙腈为色谱纯，其他未注明试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 µm）酰胺键合的杂化硅胶色谱柱，柱温30 ℃；流动相为乙腈-0.2%三乙胺（65:35），流速1.0 mL·min-1；电喷雾检测器（雾化温度50 ℃；幂率1.15；采样频率10 Hz；过滤常数5.0 s）；进样量20 μL。
2.2 溶液的制备 2.2.1 系统适用性溶液精密称取蔗糖、果糖、葡萄糖和棉子糖的对照品适量，用溶剂（50%乙腈水）溶解并稀释成蔗糖质量浓度为5.0 mg·mL-1，果糖、葡萄糖、棉子糖的质量浓度均为50 μg·mL-1（约相当于1%的浓度）的混合溶液，即得。
2.2.2 系列对照品溶液取蔗糖对照品适量，用溶剂溶解并稀释制成质量浓度分别为0.3、0.4、0.45、0.5、0.67、0.7、0.8 mg·mL-1以及5、10、25、50、80、100 μg·mL-1的系列溶液，即得。
2.2.3 含量测定用溶液精密称取蔗糖样品约10.0 mg，置20 mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含量测定用供试品溶液；精密称取蔗糖对照品适量，同法配制得蔗糖对照品溶液（0.50 mg·mL-1）。
2.2.4 有关物质测定用溶液取蔗糖样品约50.0 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加溶剂适量，超声使溶解，用溶剂稀释定容至刻度，摇匀，即得有关物质测定用供试品溶液（5.0 mg·mL-1）；精密量取供试品溶液1.0 mL，置100 mL量瓶中，加溶剂稀释定容至刻度，作为对照溶液（50.0 μg·mL-1）。
2.3 专属性 2.3.1 系统适用性试验精密吸取系统适用性溶液及空白溶剂各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图（图 2），结果表明，溶剂对主峰无干扰，各已知杂质峰之间以及杂质峰与蔗糖主峰之间均能有效分离，以蔗糖色谱峰计算理论板数大于5 000。
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1.果糖（fructose）2.葡萄糖（glucose）3.蔗糖（sucrose）4.棉子糖（raffinose） 图 2 系统适用性溶液（A）和空白溶剂（B）高效液相色谱图 Fig.2 HPLC chromatograms of system suitability solution(A)and blank solvent(B) |
取蔗糖样品分别经过酸（1.0 mol·L-1盐酸溶液）破坏1 h、碱（1.0 mol·L-1氢氧化钠溶液）破坏1 h、氧化（30% H2O2）破坏30 min、光照（紫外254 nm）24 h和高温（100 ℃）1 h破坏。取破坏后溶液20 μL，注入液相色谱仪，依“2.1”项色谱条件分离测定，记录色谱图（图 3）。结果显示，蔗糖在光照、碱破坏条件下较稳定，但在酸性、高温和氧化破坏下易降解生成葡萄糖和果糖。经考察，该方法对蔗糖可能的降解产物及有关物质有良好的分离效果，专属性较好。
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1.果糖（fructose）2.葡萄糖（glucose） A.热破坏溶液（heat stress solution）B.光破坏溶液（UV stress solution）C.氧化破坏溶液（oxidative stress solution）D.碱破坏溶液（alkaline stress solution）E.酸破坏溶液（acid stress solution）F.未破坏溶液（original solution） 图 3 蔗糖破坏试验色谱图 Fig.3 The chromatograms of stress solution |
取“2.2.3”项同一对照品溶液，依“2.1”项条件连续测定6次，记录蔗糖色谱峰保留时间和峰面积。结果蔗糖保留时间和峰面积的RSD分别为0.027%和0.31%。进样精密度良好。
2.4.2 重复性取同一批号蔗糖样品6份，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件以外标法测定含量。结果含量平均值（n=6）为100.3%，RSD为0.61%。
2.5 检测下限（LOD）和定量下限（LOQ）取蔗糖对照品溶液逐步稀释至合适浓度，进样测定。按信噪比（S/N）约为3:1计算，蔗糖的LOD为1.49 μg·mL-1；按S/N约为10:1计算，LOQ为4.95 μg·mL-1。
2.6 线性与范围精密吸取“2.2.2”项的系列对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以蔗糖峰面积（Y）为纵坐标，对照品溶液浓度（X）为横坐标，绘制线性工作曲线；蔗糖质量浓度在0.30~0.80 mg·mL-1范围，得到回归方程：
| $ Y = 25.089X + 4.819{\rm{ }}5\;\;\;\;r = 0.999{\rm{ }}0 $ |
蔗糖质量浓度在4.95~99.08 μg·mL-1范围，得到回归方程：
| $Y = 0.052{\rm{ }}1X + 0.239{\rm{ }}0\;\;\;\;r = 0.999{\rm{ }}0 $ |
0.30~0.80 mg·mL-1与4.95~99.08 μg·mL-1分别作为蔗糖含量及有关物质检查的线性范围。
2.7 溶液稳定性取“2.2.3”项下同一对照品溶液，在24 h内每隔2 h进样分析，测得蔗糖峰面积的RSD为1.4%，表明蔗糖溶液在24 h内稳定性良好。
2.8 回收率精密称取一批蔗糖样品适量，用溶剂配制成低、中、高（80%、100%、120%）3个浓度水平的溶液各3份，作为回收率供试溶液。取回收率供试溶液和蔗糖对照品溶液（0.50 mg·mL-1）在上述色谱条件下进样分析，并用外标法计算该样品含量的平均回收率（n=9）为100.6%，RSD为0.68%，表明建立的方法准确度良好。具体结果见表 1。
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表 1 蔗糖回收率试验结果（n=9） Tab.1 Recovery and relative standard deviation of sucrose |
本实验通过调节柱温（25、35 ℃）、流速（0.9、1.1 mL·min-1）和流动相比例（60:40、70:30），考察蔗糖主峰与可能杂质之间的分离情况。结果表明蔗糖与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，符合《中国药典》要求，可见方法耐用性良好。
2.10 校正因子精密称取果糖、葡萄糖和棉子糖的对照品适量，用溶剂配制为系列对照品溶液，按上述色谱条件进样分析，记录色谱图。以峰面积为纵坐标（Y），对照品溶液的质量浓度为横坐标（X）进行线性拟合，得到回归方程。以蔗糖线性方程斜率与已知杂质线性方程斜率的比值为该有关物质的校正因子。
结果，果糖、葡萄糖和棉子糖的校正因子分别为1.00、1.04和1.07，均未超出0.9~1.1的范围，具体见表 2。
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表 2 已知杂质校正因子结果 Tab.2 Results of correction factor of known impurities |
取蔗糖样品及对照品，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液和对照品溶液，每批样品制备2份溶液，每份溶液进样2次，按外标法以峰面积计算样品的含量。批号为161122043G、170103007D、160214301D、20151214-069的4批样品的含量分别为99.09%、99.95%、99.34%、100.48%。
2.12 有关物质测定取蔗糖样品，按“2.2.4”项方法制备供试品溶液和对照溶液，分别进样分析。本实验分别采用了不加校正因子的主成分自身对照法和外标法计算蔗糖样品中已知杂质，4批蔗糖样品的有关物质测定结果见表 3。
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表 3 蔗糖有关物质2种计算方法测定结果 Tab.3 Results of the determination of related substances of sucrose by two methods |
蔗糖是强极性化合物，无法在ODS柱上有效保留，难以实现化学结构类似的寡糖之间的有效分离。目前主流方法采用硅胶氨基柱或强阳离子型交换色谱柱对蔗糖进行分析，存在柱流失严重，方法不耐用等缺点。近年来，随着色谱柱填料技术的发展，HILIC技术在分析强极性化合物方面的优势得到显现。为此，本文在研究过程中尝试了Thermo Hypersil Gold HILIC、Accurcore Amide HILIC和Waters XBridge Amide 3种HILIC色谱柱，最终发现Waters XBridge Amide比较适合蔗糖的分离检测，主要表现在以下方面：（1）分离能力最佳，可以实现主要杂质之间基线分离；（2）柱流失较少，基线噪音小，提示其更为适合检测气溶胶为主的ELSD、CAD及NQAD等检测器；（3）耐用性明显优于硅胶基质的氨基柱；（4）价格合理，可用于常规分析。上述几点弥补了现有药典中其他糖类采用硅胶氨基柱或强阳离子交换柱的不足。
3.2 流动相的选择对于糖类物质的分析采用的流动相是含有少量水/缓冲液或其他极性溶剂的高有机相（> 60%）溶液，极性大的流动相比例保持至少5%，保证色谱柱固定相表面形成富水层。当选用质子溶剂做有机相时，该溶剂会与固定相的极性富水层表面产生氢键作用力，影响分离效果和峰形，所以本实验选择乙腈为流动相的有机相。
由于具有光学活性的还原糖（果糖和葡萄糖）在水溶液中具有变旋现象，在流动相为乙腈-水时表现为色谱图中峰形分叉，不能对其准确定量。而碱性环境或高温条件对还原糖溶液的变旋现象有稳定作用[17-18]，使2种差向异构体变成1个峰，同时考虑到高温对色谱柱寿命的影响，最终将流动相的水相定为三乙胺的水溶液。
试验对不同浓度的三乙胺进行考察，结果发现随着流动相中三乙胺浓度的升高，化合物的峰形变得更好，特别是对还原性糖。推测原因是流动相中三乙胺浓度的增大，增加了Amide固定相与流动相之间形成的极性富水层的厚度，从而使待测物与固定相之间的作用更加彻底。同时又考虑到色谱柱的耐受范围，将三乙胺溶液的浓度确定为0.2%。流动相中有机相增加会延长分析时间，改善分离度；水相增加利于糖类物质的溶解，改善峰形。本实验选择乙腈-0.2%三乙胺（70:30、68:32、65:35）的不同比例进行对比，在既保证分离度，又尽量缩短分析时间并且提高效率的情况下，最终确定流动相乙腈-0.2%三乙胺比例为65:35。
3.3 检测器参数优化CAD中关键参数主要有雾化温度、采集频率和过滤常数以及幂率。本研究考察雾化温度LOW（35 ℃）档和HIGH（50 ℃）档，发现信号响应并无显著差异，但雾化温度为HIGH（50 ℃）时背景噪音较低，故选用雾化温度为HIGH档（50 ℃）。实验选择10 Hz采样频率和5.0 s的过滤常数，该条件下色谱峰采样点数量充足，色谱图较为平滑。幂率（power function value，PFV）分别为1.00、1.10、1.15时对蔗糖对照品溶液进样分析，并对色谱峰面积和溶液质量浓度进行线性拟合，结果见表 4。结果表明，蔗糖分析时PFV为1.15线性最优。综上，本实验最终确定雾化温度为50 ℃，采集频率为10 Hz，过滤常数为5.0 s，幂率为1.15。
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表 4 幂率的优化 Tab.4 PFV parameter optimization |
目前，作为药用辅料用蔗糖的国内外法定质量标准中，均无含量和有关物质控制项目。本研究根据蔗糖结构及来源，同时参考EP 9.4蔗糖溶液[19]5448，提示药用辅料级蔗糖中可能存在果糖、葡萄糖和棉子糖等杂质。为更好地控制蔗糖辅料的质量，保证目标分析物与相关杂质完全分离，本研究将果糖、葡萄糖和棉子糖等均列入系统适用性考察项目。由“2.3”项的实验结果可见，本研究建立的方法能有效分离果糖、葡萄糖和棉子糖，且不干扰蔗糖主成分的测定。
3.5 线性与范围的确定CAD作为质量型检测器，与ELSD类似，其响应与浓度之间为非线性关系，但在一定的浓度范围内可呈良好的线性。由“2.6”项的试验结果可知，蔗糖质量浓度在0.30~0.80 mg·mL-1与4.95~99.08 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好（r=0.999）。除此之外，CAD特有的“线性校正”参数PFV，可以提高其线性响应范围。为了准确地反映样品中蔗糖及杂质的含量，本实验将0.30~0.80 mg·mL-1与4.95~99.08 μg·mL-1分别作为有关物质及含量测定的线性范围，同时使用外标法计算结果简便准确。
3.6 有关物质计算方法的确定因果糖、葡萄糖和棉子糖的校正因子均在0.9~1.1之间，故本研究在有关物质计算时分别采用不加校正因子的主成分自身对照法和外标法进行计算，并将2种方法的计算结果进行统计分析，结果显示Sig值为0.437，大于显著性水平0.05，因此认为对于已知杂质的计算采用不加校正因子的主成分自身对照法和外标法之间无显著性差异。综上，本实验选择不加校正因子的自身对照法对已知杂质进行计算。
4 小结国外各部药典均未对蔗糖辅料的含量及有关物质进行控制，《中国药典》2015年版四部药用辅料蔗糖标准中也无“含量测定”和“有关物质”检查项目，仅在【性状】项下规定了比旋度的范围。本文建立了HPLC-CAD法测定蔗糖含量和有关物质，该法的专属性更强，耐用性较好，经济高效，不仅填补了《中国药典》2015年版中蔗糖含量与有关物质测定的空白，也为糖类物质的检测方法提供了新的思路。CAD作为一种通用型检测器，目前在国内外应用前景较好，更利于该方法的应用和推广，同时也为其他弱紫外吸收或无紫外吸收的药物和辅料的质量控制和分析研究提供了新的选择。
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