环境保护是人类社会可持续发展的重要保证。近些年来，化学污染所造成的环境问题引起了广泛的关注，绿色化学应运而生。绿色化学是利用化学技术和方法减少和消除对人类健康和环境有毒、有害的原料、产品、副产品、溶剂、试剂等的使用和废物的生成，简言之，绿色化学就是防止污染的化学^[1]。绿色化学中化学品使用的5个基本原则，即最小化、循环利用、回收利用、再生利用和拒绝使用危害品的原则已经在化学工业的许多领域得到了普遍的重视与应用。

分析化学是化学中的重要领域，它的最终产品是分析数据和结果，但在分析方法研究和分析检测过程中大量使用溶剂和试剂，消耗能源，并产生废气、废液等。有人估算，1台典型的液相色谱仪每天产生1 L有机废液，全球约13万台运行的仪器每年则可产生3.4×10⁶ L有机废液^[2]。样品制备和处理产生的废物使得这个数字更加巨大。再加上分析试验室的数量庞大，分布分散，对其污染的控制十分困难。因此，提倡绿色分析化学，减少毒性溶剂和试剂的使用；减少样品前处理和分析过程中溶剂的使用量；开发毒性溶剂与试剂的替代方法，以及不使用溶剂与试剂的直接测定方法；分析仪器的微型化以及新的纳米技术的引入已经成为分析化学发展的方向^[3]，大量“绿色化”的分析检测技术^[4-5]得到开发和应用。

《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）自1985年版起，特别是2005年版以后，中药质量标准逐步完善，大量采用薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱等分析方法，对中药的特征性或指标性成分进行检测，极大提高了中药的质量控制水平。然而，这些方法大部分仍然是传统的常量分析模式，耗费溶剂量大，分析时间长，废弃物不能有效处理。不容忽视的是中药检验控制质量的同时，造成的污染也是十分可观的，与绿色分析化学的要求有较大差距。本文拟从中药检测方法的样品前处理、高效液相色谱的应用以及对照品的替代等方面探讨研究、转移“绿色化”检测技术方法，形成“绿色化”中药检测标准的思路。

1 常用溶剂的毒性分类

根据溶剂的安全性，包括生物安全性（致癌、致崎、致突变）、自身的安全性能（闪点、蒸汽压、静电荷、过氧化等）、以及对环境的影响程度（生态毒性、水污染、臭氧减少和光化学反应），文献^[6]113将常用分析溶剂分为首选、可用和有害的3类（表 1）。文献[6]也总结了有害溶剂的可替代溶剂或组合（表 2）。

在现阶段的分析检测中，有机溶剂的使用还是不可避免的。环境友好、健康和安全是中药检测方法中提取溶剂或色谱溶剂选择的基本原则，需认真研究替代溶剂的有效方法，最大限度地避免有毒有害溶剂的使用。

2 分析样品前处理的“绿色化”方法

中药成分复杂且在样品中的含量较低，样品测定前的处理，包括提取、纯化、富集等，是必不可少的。按照绿色分析化学的理念，供试品溶液的制备应减少有机溶剂的消耗，减少废物的产生与扩散，禁用毒性溶剂，节省时间和能源^[7]。样品处理是整个分析过程中消耗溶剂、试剂最多的步骤。因此，改进供试品溶液制备方法以减少溶剂的使用，是中药检验绿色化的关键内容。

2.1 顶空气相提取和顶空固相微萃取

中药挥发性成分的研究与检测多采用传统的水蒸气蒸馏（steam distillation，SD）的方法，该法耗时长，样品消耗量大，且高温提取易使挥发性组分降解或产生化学变化。顶空（headspace，HS）气态提取是在达到平衡的密闭容器（顶空瓶）中液体或固体分析物的顶部空间取气态样品检测，或GC直接顶空进样，进行检测的分析技术。顶空气态提取是完全的“无溶剂”绿色提取方法。顶空固相微萃取（headspace solid-phase micro extraction，HS-SPME）是采用顶空装置和固相萃取头（有不同商品型号的固相萃取填料）对样品的气态成分进行简单快速的提取、富集的技术，可以使样品提取过程大为简化，分析的速度和灵敏度大大提高。采用顶空进样与SD/GC-MS法分析杠板归中挥发性成分^[8]，顶空直接进样测得42种化合物，含量都大于0.10%；SD法检测到61种化合物，含量大于0.10%的只有33种，2种方法差别较大。HS-SPME法与SD法提取姜黄挥发性成分的比较^[9]，显示HS-SPME法所得挥发性成分数目和种类较多，比SD法具有明显的优越性。

2.2 样品提取的小型化或微型化

《中国药典》2015年版一部收载的鉴别或含量测定方法，均为常量分析方法，一般按g取样，几十至数百mL溶剂提取、液-液萃取（LLE）等。由于后续的仪器测定方法仅需使用10~20 µL溶液，大量的供试品溶液被废弃。如黄芪中黄芪甲苷的含量测定^[10]302，取样品粉末4 g，索氏提取4 h，需要消耗甲醇100~150 mL；LLE用正丁醇160 mL；大孔树脂洗脱需75%乙醇80 mL；完成1个样品的测定以平行2份计算，至少消耗640 mL有机溶剂，而制得的5 mL供试品溶液仅用20 µL进样测定。上述方法耗费时间长（至少1 d时间），溶剂消耗量大，还造成后续污染，缺陷是很明显的。在标准研究中，应注意尽量减小供试品溶液的制备规模，包括减少取样量，减少溶剂使用量，考察在保证测量精度的前提下，将g-mL级规模减小到mg-μL级的可能性。近年来，各种小型化或微型化的提取、纯化方法在中药的检测中得到应用。快速溶剂萃取（accelerated solvent extraction，ASE）是一种在较高的温度和较大的压力下，用溶剂提取固体或半固体的样品前处理方法，具有有机溶剂用量少及提取速度快的优点。黄北雄等^[11]报道采用ASE-HPLC测定保和丸中橙皮苷的含量，与《中国药典》的样品处理方法比较，提取溶剂甲醇由80 mL减少到5 mL；样品提取时间由16 h降低到约0.5 h，测定结果一致。廖强等^[12]报道用ASE-HPLC法快速测定决明子中大黄酚和橙黄决明素，ASE法测得的大黄酚含量比《中国药典》方法略高一些，而测得橙黄决明素含量则高出约2倍左右，分析其原因，可能是按《中国药典》方法提取2 h橙黄决明素并不能完全提取。采用ASE法整个提取时间仅为20 min，仅为《中国药典》方法（需3 h）的1/9，说明ASE法要比《中国药典》方法在提取效率和速度上更高效、快速。加速溶剂提取的实例还有较多报道^[13-15]。

2.3 液相微萃取

液相微萃取（LPME）技术是在LLE的基础上发展起来的，可降低LLE过程中大量有机溶剂的使用。目前，发展较为成熟的LPME模式主要有分散液-液微萃取（DLLME）^[16]、单液滴微萃取（SDME）^[17-19]、中空纤维液相微萃取（HFLPME）^[20]、顶空液相微萃取（HSLPME）^[21]和动态液相微萃取（DLPME）^[22]等。程艳芹等^[23]发表的文章“液相微萃取技术的研究进展及其在中药分析中的应用”，综述了LPME技术用于中药及其制剂中生物碱、木脂素、蒽醌、黄酮、有机酸类化合物及挥发油的分析方法。其他报道的应用方法还有液-液微萃取（LLME）/HPLC-MS测定五指毛桃水提取液中的补骨脂素与佛手内酯^[24]，DLLME快速测定中药中4种呋喃香豆素化合物^[25]，DLLME-HPLC法测定藿香正气口服液中厚朴酚与和厚朴酚含量^[26]，HSLPME/GC-MS对中药枳壳中有机挥发物的快速分析^[27]等。

2.4 固相萃取和固相微萃取

固相萃取（SPE）是利用固相基质表面的键合相与待测成分之间的作用，将待测成分与基液中其他干扰成分分离，得到纯化、富集的方法。《中国药典》2015年版一部小儿清肺化痰口服液^[10]556、克咳片^[10]926、复方川贝精片^[10]1209项下采用阳离子交换反相吸附剂为填充剂的SPE法纯化样品，测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的含量；附桂骨痛片^[10]1015采用同法测定乌头碱、次乌头碱和新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰乌头原碱含量；消炎止咳片^[10]1414测定吗啡、磷酸可待因、盐酸罂粟碱含量，是SPE应用于药品标准的实例。SPE可采用的固定相填料有多种，包括硅胶基及聚酯基键合C₈、C₁₈填料，氧化铝、硅胶等极性吸附填料，离子交换吸附树脂以及分子排阻填料等，需要较少的洗脱溶剂，是较好的替代LLE的方法。

固相微萃取（SPME）是以涂渍在石英玻璃纤维上的固定相（高分子涂层或吸附剂）作为吸收（吸附）的介质，对目标成分进行萃取和富集，GC进样口直接热解吸（或用HPLC流动相冲洗LC柱分析，或直接进行MS分析）的样品处理技术。这一技术较适用于挥发性和半挥发性有机物的样品处理和分析，在环境污染物，如农药残留、酚类、多氯联苯、多环芳烃等检测中应用十分广泛。SPME技术的发展极其迅速，从萃取头材料、装置改进、设备自动化和高通量分析，应用范围扩大，新技术不断涌现^[28]。SPME有静态和动态2种基本模式。静态SPME有萃取丝、萃取薄膜、悬浮颗粒、萃取棒、转动饼等；动态SPME有毛细管微萃取技术，管内聚合物涂层、涂层丝填充、吸着剂填充及整体柱填充等。动态SPME可与GC、LC及MS等实现联用。SPME在中药分析检测中的应用有详细的综述报道，其中，利用HS-SPME-GC检测挥发性成分的报道最多^[29-30]。作为绿色样品制备技术，SPME方法在中药挥发性成分分析中的应用主要是采用SPME萃取头固相微萃取装置进行提取、纯化，如静态HS-SPME-GC/MS分析砂仁的挥发性成分^[31]，SPME气质联用测定中药辛夷挥发性成分等^[32]。

3 HPLC“绿色化”方法

绿色化学的核心是减少溶剂，特别是毒性溶剂的使用。常规HPLC使用大量甲醇、乙腈等有机溶剂为流动相。绿色色谱技术的尝试主要包括通过色谱的微型化以及高温色谱等以减少毒性溶剂的使用量。

3.1 微型化HPLC（miniaturization HPLC）

LC的微型化最初是为了提高灵敏度，满足蛋白质组学检测低丰度肽和蛋白质，提高与质谱连接效率的需要，相应的纳升级、毛细管级及微流液相色谱仪器的开发也为实现降低溶剂的消耗提供了可能^[34]。目前，中药标准中已经出现了应用UPLC或UHPLC，使用细径柱（2.1 mm）的LC分析方法，如阿胶、龟甲胶和鹿角胶的特征肽鉴别方法^{[10]189，181，322}等。

LC中，分离度仅取决于柱长和固定相粒度^[6]210。柱内径的大小不影响分离度，柱内径越小，所需的流动相流速降低，而检测的相对灵敏度[F=（i.d_conventional/i.d_downscaled）²]越高。流速减低为1/F；同时灵敏度提高F倍。表 2是色谱柱内径与所需流速及相对灵敏度的关系。仅从使用4.6 mm改为3.0 mm内径色谱柱，溶剂即可节省50%。

从不同粒径固定相的线速率与板高的关系可以看出^[6]235：固定相粒径越小，有效板高（HETP）越小，柱效则越高；使用小粒径固定相填料，因理论板数高，可减小柱长，此时流速不变，分离时间可明显缩短，从而达到节省溶剂的目的。

在药品标准中，扩大使用不断成熟的LC微型化技术，如UPLC或UHPLC的分析检测方法，可在药品生产企业、药品检验机构作为法定方法得以应用，对促进检测方法的绿色化具有极大的辐射作用。

3.2 高温HPLC（elevated temperature HPLC）

温度能够影响LC分离中的多个物理常数^[6]214，调节分离，缩短分离时间。温度升高，流动相的黏度降低，分析速度提高，有机溶剂的使用量减少；可以使用黏度大的乙醇代替甲醇或乙腈等有机相，更经济和环保。温度升高可以增加被分离物质在流动相和固定相之间的平衡速率，改善分离度和选择性，使单位时间的分离效率更高。

由于一般的硅胶键合固定相的限制使用温度为60 ℃，不适用于高温HPLC。近年来出现了石墨化碳、氧化锆、聚苯乙烯或其他聚酯基键合的固定相填料，最高可耐200 ℃高温，得到了很好的应用^[6]221。高温HPLC除需要色谱柱加温外，还需要柱前流动相系统的预热以及柱后冷却等装置。虽然从20世纪80年代后期就出现了高温HPLC的研究报道，但商品化仪器设备仅有Selerity Technologies^[34]推出的高温HPLC和温度程序HPLC仪器。

4 中药对照物质的“绿色化”策略与方法

中药化学对照品是药品检验及质量控制中使用的实物对照。自《中国药典》1985年版以来的30多年间，随着中药标准的不断提高与完善，中药化学对照品的品种数量大幅提升，中国食品药品检定研究院分发的中药化学对照品已达到近700种，为《中国药典》及国家药品标准的实施提供了有效的保证。然而，中药化学对照品的提取、纯化制备难度很大，耗费巨大的药材资源；分离制备中大量有机溶剂、分离填料的使用必然带来一定的化学污染。另一方面，中药化学对照品价格高昂，也带来检验检测成本的攀升。近年来，国内外在对照品的替代研究方面取得了良好的进展，欧洲药典（EP）和美国药典（USP）在草药和食品补充剂品种的标准中替代对照品，以及对照提取物的使用方面取得了很大的进展^[35-36]。《中国药典》2015年版一部中收载了黄连等多个品种的“一测多评”（或称“一标多测”）方法，以及功劳木、银杏叶提取物及其制剂等的定量用对照提取物对照的检测项目，为替代对照品方法的建立和使用提供了范例。对照品的替代使用将为中药检测方法的“绿色化”提供更有效的技术手段和途径。

4.1 “一测多评”（或称“一标多测”）替代方法

“一测多评”方法适用于对照品难以获得，或制备成本高，或不稳定的情况下同类多成分的同时测定。该方法利用成分间的函数关系和比例关系，以1个成分为内标物，建立该成分与其他测定成分的相对校正因子（RCF），通过RCF计算其他成分含量^[37-39]。一测多评方法的建立和应用中最为关键的是待测成分色谱峰定位方式的确定以及RCF的准确定值。色谱峰定位方式有相对保留时间^[38-40]、相对容量因子^[41]、线性回归色谱峰定位法^[42-43]，以及对照提取物辅助定位^[44]等方法；RCF的测定方法有多点校正法和斜率校正法等^[43]。药品标准中采用的RCF量值应经过多个实验室的协作标定。

4.2 对照提取物替代方法

《中国药典》2015年版< 国家药品标准物质通则 > ^[45]明确：“对照提取物系指经特定提取工艺制备的含有多种主要有效成分或指标性成分，用于中药材（含饮片）、提取物、中成药等鉴别或含量测定用的国家药品标准物质。”对照提取物不需要烦琐的制备分离，节省资源；“一物多标”，可体现多指标检测和质量控制的优势。鉴别用对照提取物可以是中药材的有效部位或指标成分的提取物、油脂、挥发油等，主要用于药品标准中采用TLC、HPLC或GC法的鉴别项，溶解或稀释即可使用，较为方便快捷。美国药典（USP）草药和食品补充剂品种的标准中，常用对照提取物作为含量测定中色谱峰的定位，配合“一测多评”（或称“一标多测”）方法使用，如灵芝^[44]6641、积雪草^[44]6542、穿心莲^[44]6459、丹参^[44]6559等品种。含量测定用对照提取物是含有明确的有效成分或指标成分的对照物质，不仅可作为由于各种原因难以制备的单体对照品，或价格昂贵的单体对照品的替代使用，而且因其含有的多个成分或指标，更易于实现多组分测定。对照提取物的量值需要从标示成分的单体对照品（一级标准物质，primary standard）溯源得到^[35]。从使用的精密度和量值传递的准确性考虑，对含量测定用对照提取物的“纯度”应该有一定要求。中国食品药品检定研究院分发的三七总皂苷对照提取物经实验室协作标定^[50]标示的三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁、人参皂苷Re、人参皂苷Rb₁和人参皂苷Rd的总量达到70%以上^[46]；银杏叶总内酯对照提取物中银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的总量为90%以上^[47]。均匀性、稳定性和准确定值是制备含量测定用对照提取物的关键，而协作标定是量值溯源的通行方法。近年来，含量测定用对照提取物的制备、定值及其在中药品种中的应用已有较多报道^[49-53]，为药品标准的应用提供了基础。中药对照物质应用模式的多样性可以在很大程度上缓解中药单体对照品制备的压力，降低检验成本；并可克服单体对照品一对一测定的局限性，可同时测定中药及其制剂中共存的生物活性成分或指标成分，显示了多指标评价的优越性。

4.3 结语

综上，为了人类的健康和可持续发展，化学检测技术方法以及相应的药品标准也须从源头上减少有毒有害溶剂的使用，减少废弃物的产生与排放，减少中药材资源的浪费，这是必然的趋势。研究和替代中药质量标准中“耗能”、“污染”的分析方法，在中药质量检测中实施“绿色化”，任重而道远。