2019, Vol. 39 
2. 天津农学院农学系, 天津 300384
2. Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China
川贝母是我国传统名贵中药材，具有化痰止咳的功效[1]，已被广泛应用于中成药中[2]。川贝母的正品包括川贝母（F. cirrhosa D. Don）、暗紫贝母（F. unibracteata Hsiao et K. C. Hsia）、甘肃贝母（F. przewalskii Maxim.）、梭砂贝母（F. delavayi Franch.）、太白贝母（F. taipaiensis P. Y. Li）、瓦布贝母[F. unibracteata Hsiao et K. C. Hsia var. wabuensis（S. Y. Tang et S. C.Yue）Z. D. Liu，S. Wang et S. C. Chen]。与川贝母同属贝母属的常见混淆品有伊贝母[包括新疆贝母（F. walujewii Schrenk.）和伊犁贝母（F. pallidiflorae Schrenk.）]、浙贝母（F. thunbergii Miq.）、湖北贝母（F. hupehensis Hsiao et K.C.Hsia）、平贝母（F. ussuriensis Maxim）。因形态相似，川贝母很容易与贝母属中的其他物种混淆使用，严重影响临床疗效[3-4]。因此，建立快速、便捷、操作性强的川贝母鉴别方法，对中药材市场的监管及中医中药的健康发展具有重要的现实意义。
环状等温扩增技术（loop mediated isothermal ampli fication，LAMP）[5]是一种新颖的核酸扩增技术，它依赖于识别靶DNA上6个特定区域的4~6条引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下高效扩增靶标序列，反应结果可通过肉眼观察，具有高特异性、快速、灵敏、操作简单等特点。自2000年该技术产生以来，在引物设计[6]、反应速度[7-8]和产物检测[9-10]方面都有较大改进，在临床疾病的诊断、流行性细菌以及病毒的检测等方面应用广泛[11-13]。
本研究基于荧光-LAMP，依据川贝母物种特异性序列设计5套LAMP引物，并测试特异性和灵敏度，建立了川贝母快速检测方法。
1 仪器与试药 1.1 仪器LA-320CE实时浊度仪（日本荣研），金属加热块（Labnet），微量核酸蛋白测定仪（ND-1000），Mettler Toledo PL602-L分析天平（精度0.01 g）；组织研磨仪（Retsch MM400），高速离心机（Thermo PICO 21）。
1.2 试药新型植物基因组DNA提取试剂盒（天根，DP320），环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒（蓝谱生物）。
2 方法与结果 2.1 DNA提取方法试验材料基因组DNA使用新型植物基因组DNA提取试剂盒进行提取。DNA提取液使用核酸蛋白测定仪测量DNA的浓度，并统一稀释至25 ng· µL-1，4 ℃保存备用。
2.2 LAMP引物的设计参照文献[14]中获得的川贝母特异性序列，经测序验证后用于LAMP引物设计。引物设计使用在线设计软件PrimerExplorer V5（LAMP Primer designing software，http://primerexplorer.jp/e/），共设计LAMP引物5套（见表 1），由金唯智公司合成，纯化级别为HPLC。
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表 1 川贝母物种特异性引物、探针 Tab.1 Species-specific primers and probes for Fritillaria |
每套引物中，将每条引物配制成浓度为100 µmol·L-1的母液，取外引物F3、B3母液各1 µL，内引物FIP、BIP母液各8 µL，环引物（LF和/或LB）母液各1 µL，灭菌去离子水补足20 µL并充分混合，即为引物混合溶液。
2.3 LAMP反应体系浊度法LAMP反应体系总体积为25 µL，其中2×反应液（RM）12.5 µL，Bst DNA聚合酶（Bst DNA Polymerase）1 µL，引物混合溶液1 µL，DNA模板（25 ng· µL-1）1 µL，用灭菌去离子水补至25 µL，充分混匀后，置于LA-320CE浊度仪中；反应程序为63 ℃扩增60 min，80 ℃灭活2 min。反应过程中，对反应管浊度进行实时测量，每6 s检测反应管在650 nm处吸收度，生成浊度变化曲线，当反应体系浊度超过0.25以及浊度的变化速率大于0.1时，结果判定为阳性。
可视法LAMP反应体系总体积也为25 µL，是在浊度法LAMP反应体系中再加入显色剂1 µL（钙黄绿素和氯化锰），用灭菌去离子水补至25 µL，充分混匀后，置于金属加热块上，于63 ℃温浴60 min。反应结束后，通过肉眼观察反应体系的颜色变化判定结果，颜色由黄色变为浅绿色判断为阳性。
2.4 川贝母LAMP方法引物筛选以川贝母基因组DNA（10%）为模板，对设计的5套候选引物进行浊度法LAMP反应。结果（图 1）表明，第1、4、5号引物的扩增体系有浊度信号，出现时间为29.32、31.42、32.54 min，变化速率为0.177、0.175、0.164，其中1号引物信号出现时间最早（图 1-A），变化速率最高（图 1-B），表明扩增效率最好，因此确定选择引物Set 1为川贝母环状等温扩增鉴定引物。
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A.浊度变化曲线（turbidity change curve）B.浊度变化速率（turbidity change rate） 图 1 川贝母候选引物LAMP扩增结果 Fig.1 Primer screening of Fritillaria cirrhosa LAMP assay |
分别以6种川贝母基源植物和7种常见混淆品为对象（10%基因组DNA为模板），测试建立的川贝母LAMP鉴定方法对常见混淆品特异性。基源植物中川贝母购自中国食品药品检定研究院，暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、太白贝母、瓦布贝母由本实验室收集保存，并经DNA条形码测序方法验证。常见混淆品中平贝母、伊贝母购自中国食品药品检定研究院；新疆贝母、浙贝母、东贝母、土贝母、皖贝母由本实验室收集保存，并经DNA条形码测序方法验证。
结果显示，本方法能够从6种川贝母基源植物的DNA样品反应管中检测出浊度曲线（图 2-A和2-B），可视化检测时，对应反应管也发生由黄色转为绿色的颜色变化（图 2-C），反应结果为阳性；而在7种混淆品DNA样品反应管中均未检测出浊度（图 2-D和2-E）和荧光变化（图 2-F），反应结果为阴性。上述结果表明，本研究建立的方法具有良好的特异性。
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图 2 川贝母LAMP特异性测试结果 Fig.2 Specificity of Fritillaria cirrhosa LAMP assay |
将提取的川贝母基因组DNA（25 ng· µL-1）用鲑鱼精DNA（25 ng· µL-1）进行梯度稀释，稀释梯度依次为100%、10%、1%、0.1%、0.01%和0%，并以此为模板进行LAMP扩增反应，测试方法的灵敏度。结果表明，浊度法LAMP反应在含量为100%~0.1%样品反应管中均检测到浊度信号变化（图 3-A），开始时间分别为20.5、29.2、39.1和49.2 min；可视化LAMP反应在含量为100%~0.1%样品反应管中均明显观察到颜色变化（图 3-B），反应结果为阳性。说明本研究建立的川贝母LAMP检测方法灵敏度可达到0.1%。
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图 3 川贝母LAMP检测方法灵敏度结果 Fig.3 Sensitivity of Fritillaria cirrhosa LAMP assay |
以往的川贝母鉴别方法有形态学特征鉴别[15-16]、有效成分理化鉴别[17]和PCR鉴别等[1]。形态学特征鉴别仍然是目前最常见的鉴别方法，但是该方法要求技术人员具备较强的中药学背景及丰富的识别经验，不易掌握；有效成分理化鉴别方法针对川贝母中有效成分进行光谱和色谱分析，能有效鉴别出中药材功能成分的高低，但是不能满足药材身份鉴定的要求；随着PCR技术的发展和对检测要求的不断提高，各种PCR技术被用于川贝母的鉴别当中[18-19]。在2015年版《中华人民共和国药典》一部中[18]，新增了川贝母PCR-RFLP鉴别，该方法具有灵敏度高和准确度高的特点。罗达龙等[19]利用实时荧光PCR的SYBR Green染料法，实现了川贝母与平贝母、浙贝母、土贝母的特异性鉴别。但是上述基于PCR技术的鉴别方法需要PCR仪等专门的仪器设备，难以满足快速检测的需求。LAMP已经是食品检测、监测和监管的重要技术手段，特别是对于生产车间、市场加工品等临检，能够满足现场获得结果的需求。
本研究以川贝母物种特异性序列为靶标，建立基于荧光-LAMP川贝母鉴别方法。该方法具备以下特点：①速度快：恒温扩增在1 h内能够获得检测结果，如果配合快速DNA提取技术[20]，可以在1.5 h内完成从样品到结果整个鉴别过程；②操作简单：仅需要将LAMP Reaction MIX、显色剂和模板按比例混合，置于恒温加热块上扩增即可获得结果，不需要特殊的技术人才和高精尖的设备，便于操作和携带；③闭管观察结果：采用新型钙黄绿素染料，检测反应结束后，无需开盖，即可裸眼观察结果，减少了开盖带来的产物污染的影响，有效避免假阳性的产生；④灵敏度高：本方法灵敏度达0.1%，能够满足中药材、中成药中川贝母成分的检测。
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