2019, Vol. 39 
2. 河南太龙药业股份有限公司, 郑州 450000
2. Henan Tailong Pharmaceutical Shareholding Co., Ltd., Zhengzhou 450000, China
六神曲（Massa Medicata Fermentata）为辣蓼、青蒿、杏仁、苍耳草等药加入面粉混合后经发酵而成的曲剂[1-2]，是传统发酵类中药中应用最广泛的一种，具有消食化积、健脾和胃的功效，用于胸痞腹胀、饮食停滞、呕吐泄利、小儿食积等症[3-4]。目前国内各个地区的六神曲制备工艺不同，且无统一的质量标准，市场应用混乱，直接影响临床疗效，给患者带来用药风险[2]。
苦杏仁苷、青蒿素分别是杏仁和青蒿的特征性成分，苦杏仁苷具有免疫调节、抗溃疡、抗氧化、止咳和镇痛等作用[5]，青蒿素具有抗疟、抑菌等作用[6]；辣蓼和苍耳草含有黄酮类成分（芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素、山柰酚）[7-8]和酚酸类成分（香草酸、阿魏酸）[9-10]，均具有抗炎、抗菌等作用，槲皮素可用于治疗腹泻肠炎等症[11]。目前，六神曲质量标准研究多集中在黄酮类成分[11-12]，马维维等[13]采用HPLC测定六神曲发酵前后苦杏仁苷及青蒿素含量变化，未见报道同时测定六神曲中青蒿素和苦杏仁苷的含量，其黄酮类和酚酸类成分含量同时测定亦未见报道。本文采用波长切换HPLC法测定六神曲中苦杏仁苷、青蒿素、香草酸、芦丁、金丝桃苷、阿魏酸、槲皮苷、槲皮素、山柰酚9个成分含量，方法学考察表明，该方法操作简便，重复性好，可为制定六神曲的质量标准和规范提供科学依据。
1 仪器与试药Waters Alliance 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器，Waters自动进样器，Empower色谱工作站；METTLER AE240十万分之一分析天平；Shimadzu LIBROR L-160DTP万分之一分析天平；KT-350W超声波清洗机。
1.2 试药六神曲由河南太龙药业股份有限公司提供，为四川千方中药饮片有限公司、四川辅正药业股份有限公司、四川科星药业有限公司、四川百胜药业有限公司4家生产企业共A-J 10批次样品，李江华经副主任药师鉴定为中药六神曲。
对照品苦杏仁苷（批号110820-201607）、青蒿素（批号100202-201004）、香草酸（批号110776-200402）、阿魏酸（批号110773-201611）购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于99.0%；对照品金丝桃苷（批号MUST―16102605）购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度为99.76%；对照品芦丁（批号wkq16031602）、槲皮苷（批号wkq16080402，）、槲皮素（批号wkq16063005）、山柰酚（批号wkq15122003）购自四川维克奇生物有限公司，纯度均大于98%。乙腈为色谱纯（Fisher公司），磷酸、甲醇为分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件与系统适用性采用Agela Venusil XBP C18（2）硅胶色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），柱温为30 ℃，以乙腈为流动相A，0.08%磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0~12 min，10%A→15%A；12~26 min，15%A→27%A；26~42 min，27%A→40%A；42~43 min，40%A→52%A；43~62 min，52%A；62~63 min，52%A→100%A；63~73 min，100%A；73~76 min，100%A→10%A），流速为1 mL·min-1，分段变波长：210 nm（0~15 min，46~62 min，检测苦杏仁苷、青蒿素）、258 nm（15~24.9 min，27~46 min，检测香草酸、芦丁、金丝桃苷、阿魏酸、槲皮苷、槲皮素、山柰酚）、218 nm（24.9~27 min，检测阿魏酸）。进样量10 µL。在上述条件下，各组分分离度良好，见图 1。
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1.苦杏仁苷（amygdalin）2.香草酸（vanillic acid）3.芦丁（rutin）4.金丝桃苷（hyperoside）5.阿魏酸（ferulic acid）6.槲皮苷（quercitrin）7.槲皮素（quercetin）8.山柰酚（kaempferol）9.青蒿素（artemisinin） 图 1 对照品（A）、样品（B）HPLC色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B) |
精密称取苦杏仁苷、青蒿素、香草酸、芦丁、金丝桃苷、阿魏酸、槲皮苷、槲皮素、山柰酚对照品适量，加甲醇配制成质量浓度分别为31.95、595.00、17.82、17.27、20.88、75.60、15.93、8.70、13.20 µg·mL-1的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液取六神曲粉末20.0 g（过2号筛），精密称定，置于250 mL的锥形瓶中，精密加入甲醇200 mL，20 ℃以下超声提取30 min，放至室温，用甲醇补足减失的量，滤过，取续滤液150 mL，于35 ℃下减压蒸干。残渣加甲醇溶解，并定容至10 mL。
3 方法学考察 3.1 线性关系考察精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液各1、2、4、8、12、16、20 µL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以各对照品进样量（X，µg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，各成分回归方程及线性范围见表 1。
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表 1 回归方程、相关系数和线性范围（n=6） Tab.1 Regression equation, correlation coefficient and linear range |
取混合对照品溶液10 µL，连续进样6次，测定苦杏仁苷、青蒿素、香草酸、芦丁、金丝桃苷、阿魏酸、槲皮苷、槲皮素、山柰酚峰面积的RSD分别为0.72%、0.94%、0.15%、0.33%、0.41%、0.21%、0.37%、0.55%、0.84%，表明精密度良好。
3.3 稳定性试验取同一供试品溶液，室温放置，分别在制备后0、2、4、8、16、24 h按“2.1”项色谱条件进样，测定分析物的峰面积。苦杏仁苷、青蒿素、香草酸、芦丁、金丝桃苷、阿魏酸、槲皮苷、槲皮素、山柰酚峰面积的RSD分别为1.2%、0.98%、1.0%、1.2%、0.92%、1.2%、1.4%、1.0%、1.4%，表明供试品溶液在24 h基本稳定。
3.4 重复性试验取同一批六神曲样品（编号：D）20 g，共6份，精密称定，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，进样10 µL，测定峰面积，分别计算苦杏仁苷、青蒿素、香草酸、芦丁、金丝桃苷、阿魏酸、槲皮苷、槲皮素、山柰酚的含量，其平均含量分别为35.417、289.542、4.921、26.464、11.733、46.889、16.167、5.324、1.083 µg·mL-1，RSD分别为1.2%、1.5%、0.89%、0.93%、1.2%、0.77%、0.96%、1.6%、2.0%。
3.6 加样回收率试验取已知含量的六神曲（编号D）粉末10 g，共6份，精密称定，分别置250 mL具塞锥形瓶中，分别加入苦杏仁苷361.85 µg·mL-1、香草酸51.48 µg·mL-1、芦丁265.11 µg·mL-1、金丝桃苷117.79 µg·mL-1、阿魏酸468.82 µg·mL-1、槲皮苷161.53 µg·mL-1、槲皮素53.86 µg·mL-1、山柰酚µg·mL-1）的混合对照品溶液1 mL，青蒿素1.45 mg·mL-1的对照品溶液2 mL，按“2.2.2”项方法操作，按“2.1”项色谱条件进样10 µL测定，计算回收率，结果苦杏仁苷、青蒿素、香草酸、芦丁、金丝桃苷、阿魏酸、槲皮苷、槲皮素、山柰酚的平均加样回收率（n=6）分别为100.2%、100.0%、102.2%、100.5%、101.4%、99.2%、98.4%、100.9%、100.1%，RSD分别为1.7%、2.3%、2.3%、1.9%、0.98%、2.3%、2.0%、2.5%、2.3%。
4 样品含量测定取10批六神曲，分别按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1项色谱条件进行含量测定，采用外标法计算六神曲中各成分的含量，结果见表 2。
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表 2 10批六神曲的含量测定结果（µg·g-1，n=3） Tab.2 Contents in ten batches of Massa Medicata Fermentata |
为了优化提取效果，分别考察了乙酸乙酯、甲醇、无水乙醇的提取效率，结果表明甲醇的提取效果最佳。加入10倍量甲醇，比较超声提取15、30、60 min，结果表明经超声提取30 min和60 min时溶液中各成分已提取完全且差别不大，故选择超声提取30 min。
5.2 测定波长的选择本研究对检测波长进行了考察，通过3D紫外光谱图发现：检测波长为258 nm，香草酸、芦丁、金丝桃苷、阿魏酸、槲皮苷、槲皮素、山柰酚有较大吸收；检测波长218 nm，阿魏酸有较大吸收；检测波长为210 nm，苦杏仁苷和青蒿素有较大吸收，且末端吸收下基线较稳定，参考文献[14-15]，选择上述2个波长切换测定。
5.3 色谱条件的考察本研究考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.8%磷酸水及乙腈-0.8%磷酸水4种流动相系统，结果采用乙腈-0.08%磷酸水系统，各类成分均得到较好的分离。分别对Agela Venusil XBP C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 µm）、Agela Venusil ASB C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）和Water SunFireTM C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）等色谱柱进行考察，最终选择Agela Venusil XBP C18（2）硅胶色谱柱，各色谱峰分离效果最佳。
5.4 柱温的选择其他色谱条件不变的情况下，设定柱温为30、35、40 ℃，结果显示30 ℃分离效果良好，本实验选择柱温30 ℃。
6 小结建立波长切换HPLC法同时测定六神曲中苦杏仁苷、青蒿素、香草酸、芦丁、金丝桃苷、阿魏酸、槲皮苷、槲皮素、山柰酚共9个成分的含量；其含量测定结果表明，方法稳定可靠，重复性好，可用于六神曲的质量控制。
实验结果显示10批六神曲中9个成分含量差异较大，有3批次未检出青蒿素。原因可能是：①不同药品标准中，六神曲处方原料入药方式及配比不一，制法不一[2]；②六神曲在发酵工艺中存在着差异，如发酵时间长短、原料药材的质量差异等[6]；③六神曲的质量评价无统一的标准。表明保证成品质量，必须要有规范化的生产过程和合理的质量控制指标。本研究旨在探索六神曲的质量控制方法，为工业化生产提供参考。
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