2019, Vol. 39 
2. 国家药典委员会, 北京 100061
2. Chinese Pharmacopeia Committee, Beijing 100061, China
药品的微生物检验和控制是药品安全性保障的一项重要措施[1]，而供试品处理是微生物检验的重要环节，是获得较高准确性和良好检验结果的基础[2]。2015年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）四部附录1105中按照供试品的理化特性与剂型特点，将供试品分为水溶性供试品、水不溶性非油脂类供试品、油脂类供试品和需用特殊方法制备的供试品等4类[3-4]。在药品微生物限度检查时，不同剂型应采取不同的前处理方式进行供试液的制备，以达到分散均匀的目的[5]。然而，微生物的检验结果经常会受到药物种类、剂型、检验技术等多种因素的影响[6]，尤其是在建立某些油脂类药品的微生物限度检查计数方法时，常因其复杂的基质和较强的抑菌作用而导致试验菌的回收失败，即使采用薄膜过滤法处理，依然存在过滤效率低甚至薄膜堵塞的问题。十四烷酸异丙酯，又名肉豆蔻酸异丙酯（isopropyl myristate，IPM），是一种重要的无毒无刺激性的透明液体状羧酸酯类化合物，常用作局部给药制剂中许多物质的溶剂，也是许多乳膏剂的基质组分之一[7-9]。本文参照《中国药典》2015年版四部要求，模拟高、低浓度微生物污染的过程，采用十四烷酸异丙酯对模拟微生物污染的供试液—pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液萃取处理后进行微生物计数检查，通过研究各试验菌的回收率和硝酸咪康唑乳膏、曲安奈德益康唑乳膏、酮康唑乳膏的计数方法适用性实验，证明萃取法可用于油脂类乳膏药品微生物限度检查时的供试液制备，为此类样品的前处理拓展了思路。
1 仪器和材料 1.1 仪器MLS-3020型高压蒸汽灭菌锅（上海华线医用核子仪器公司），BS2202S型电子天平（德国赛多利斯公司），HFsafe-1200LC型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司），SHA-C型水浴恒温振荡器（天津鑫博得有限公司），LRH-250F型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），Aqualab 4TE型水分活度测定仪（美国DECAGON公司）。
1.2 试剂与培养基肉豆蔻酸异丙酯（批号20160627）由国药集团化学试剂有限公司生产；pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（批号1512065）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号1705126）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号170526）、胰酪大豆胨液体培养基（批号1708287）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号150916），均由北京陆桥技术股份有限公司生产，培养基适用性检查结果均符合《中国药典》2015年版的要求。硝酸咪康唑乳膏（批号160225408）、曲安奈德益康唑乳膏（批号160223530）、酮康唑乳膏（批号160128507）均由西安杨森制药有限公司生产。
1.3 菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26003〕、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10104〕、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63501〕、白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98001〕、黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98003〕，上述标准菌株均来自中国食品药品检定研究院，工作用菌株为第3代。
2 实验方法 2.1 菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24 h；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，25 ℃培养3 d。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂v/v培养基上，25 ℃培养7 d，加入5 mL含0.05%（）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，洗脱孢子，收集孢子悬液，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。
2.2 供试液的制备分别取pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液与十四烷酸异丙酯各100 mL，灭菌备用。
2.3 计数试验方法试验组，取适量“2.2”项的无菌pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液与无菌十四烷酸异丙酯各10 mL于无菌试管中混合，分别接种不大于103 cfu·mL-1和不大于104 cfu·mL-1 2个不同菌悬液浓度的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉试验菌悬液0.1 mL，混匀。分别取上层油相、下层水相各1 mL，置于直径为90 mm的无菌平皿中，每个实验组油相、水相平行2皿，加入温度不超过45 ℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基约20 mL，摇匀，待凝固后按规定温度和时间培养，观察结果。菌液组:分别加入不大于104 cfu·mL-1的各试验菌悬液0.1 mL至10 mL的pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液中，同法操作制备菌液组。对照组:除不加入菌液外，方法同试验组，另做阴性对照，平行3次试验。
各菌株回收率=（试验组平均菌落数-对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数。根据《中国药典》2015年版四部规定，若回收率为0.5~2.0，方法可用于非无菌制剂微生物限度计数检查法的样品前处理。
2.4 aw度测定[10]在温度18~25 ℃，湿度50%~ 80%的条件下，用饱和盐溶液校准水分活度测定仪。分别量取pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、十四烷酸异丙酯3 mL，迅速放入样品皿中，封闭测量仓，在温度20~25 ℃、相对湿度50%~80%的条件下测定。每隔5 min记录水分活度仪的响应值aw。当相邻2次响应值之差小于0.005时，即为测定值。仪器充分平衡后，同一样品重复测定3次。
2.5 油脂类乳膏的微生物计数方法分别取硝酸咪康唑乳膏、曲安奈德益康唑乳膏、酮康唑乳膏各10 g，加入pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液100 mL，充分震荡制成1:10供试液，取1:10供试液10 mL，加入含有10 mL无菌十四烷酸异丙酯的试管中，同时分别加入0.1 mL不大于104 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉试验菌，充分震荡萃取，静置5 min后分层，取下层水相的上层液体1 mL，加入含pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液200 mL的冲洗液中，薄膜过滤，用pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 mL。照《中国药典》2015年版四部1105要求进行方法适用性试验，计算各试验菌回收率，同法平行3次试验。
3 试验结果 3.1 微生物在油相和水相的分布结果试验结果见表 1，其中试验菌项下1、2、3为试验次数，对照组计数结果均为每皿0 cfu。采用萃取法处理后微生物主要分布于水相，当每管接种量为103 cfu时，水相中试验菌的平板计数结果均在30~300 cfu之间，结果较为准确，水相中各试验菌回收率均在0.5~2.0之间；当每管接种量为102 cfu时，水相中试验菌的平板计数结果不完全满足菌落数在30~300 cfu之间，水相中各试验菌回收率除白色念珠菌的1次实验为0.3外，大多数试验菌回收率均处于0.5~2.0之间。见表 1。
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表 1 微生物在油相、水相中的分布和水相回收率结果（cfu） Tab.1 The distribution of microorganisms in the oil phase and aqueous phase and the recoveries of aqueous phase |
通过对十四烷酸异丙酯与pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液aw测定结果发现，在25 ℃条件下十四烷酸异丙酯的aw为0.22，而pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液aw为0.99。见表 2。
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表 2 十四烷酸异丙酯与pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液aw测定结果 Tab.2 Determination of aw of IPM and pH7.0 sodium chloride peptone buffer |
硝酸咪康唑乳膏、曲安奈德益康唑乳膏、酮康唑乳膏微生物计数方法适用性试验结果各试验菌3次实验的回收率均在0.5~2.0之间，满足计数要求，可采用萃取法处理后薄膜过滤进行这3种药品的微生物计数检查。
4 讨论实验结果表明，微生物在油水两相的分布规律呈现不均匀性，其主要分布特点是微生物趋向于分布在有利于其生存的环境条件水相中。
4.1 萃取后微生物在两相系统分布结果分析微生物在萃取后油水两相中的分布状况研究主要集中在废水处理、石油、生物降解等领域[11-13]，在药品微生物方法适用性研究方面鲜有报道。多数研究者认为微生物存在于水相或者与水相关的油包水状态或者允许其生存的油相与水相的界面[14]，并且普遍认为油相不是微生物首选的栖息地因为其潜在的毒性和较高的疏水性[15], 产生该现象的原因可能与其相互作用力有关。分子生物学的研究方法如16S rRNA基因克隆文库测序和焦磷酸测序技术为深入研究微生物在油相和水相中的微生物分布提供了可能[16]。此外，水是生命不可缺少的物质，水重要的化学特征（如极性和黏结性）使其成为理想的生物溶剂[17]，而水分活度决定了微生物赖以生存的自由水的量度[18]，是水的能量状态的表征。十四烷酸异丙酯的水分活度远低于pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，在两相系统中对微生物的分布和生存更为不利。由于微生物具有趋化性[17]，微生物更倾向于分布在利于其生存的条件中。
4.2 萃取法前处理的优势和局限性萃取法应用于油脂类乳膏剂供试品的制备其作用体现在：一方面，药物基质和易溶于有机溶剂的药物成分转移到油相而有利于抑菌作用的去除和样品的后续处理；另一方面，萃取后微生物分布于水相中可使微生物计数结果更准确，有利于油脂类供试品如硝酸咪康唑乳膏等样品的微生物限度检查方法的开发[19-21]，具有较强的应用价值和优势。作为样品前处理的萃取过程是保证分布在两相系统中的微生物不死亡，且萃取转移后微生物可被检测到。然而，微生物的多样性决定了计数方法的局限性，疏水性是决定微生物非特异性粘附到各种生物和非生物表面及界面的最重要动力之一[22-23]，耐有机溶剂微生物以其多样的适应调节机制存于高浓度有机溶剂中，如溶剂泵出系统、细胞膜快速修复机制、细胞膜低溶剂、渗透性和增加细胞表面亲水性等[24]，基于上述原因和萃取效率等因素的影响，某些耐有机溶剂的微生物萃取后可能依然存在于油相中，这是本方法的局限性。然而，本研究结果符合《中国药典》2015年版微生物限度计数方法适用性试验中各试验菌回收率0.5~2.0的要求，表明该方法可满足非无菌制剂的微生物计数要求。
4.3 异常结果分析白色念珠菌低浓度第3次回收试验结果为0.30，判断为逸出值，产生这一现象可能的原因是试验菌接种量较少，试验准确度本身不高，因此低浓度试验菌回收率结果仅供参考[25]，本文主要讨论高浓度试验菌结果，其每皿平均菌落数均在30~300 cfu，准确度高[26]。
4.4 应用前景探讨在油脂类乳膏剂微生物计数法的开发中灵活使用萃取法，可有效解决因样品的油性基质导致的抑菌性难于去除和供试品难于过滤的问题。《中国药典》非无菌制剂微生物限度检查法收载的统一的检查方法解决不了药品多样性的问题，在严格执行《中国药典》要求的基础上，根据药品的特性，有针对性地建立更方便适宜的个性化检查方法，是药品微生物控制鼓励的发展方向[27]。
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