2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 浙江省食品药品检验研究院, 杭州 310052
2. Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310052, China
高血糖、高血脂、高血压俗称“三高”，这三者构成代谢综合征的主体[1]，同时随着年龄的增长，代谢综合征的发病率会越来越高[2]。另一方面，高血压、高血脂和高血糖三者可能单独存在，也可能相互关联。如高血糖患者很容易同时患上高血脂，而高血脂又是动脉硬化形成和发展的主要因素，动脉硬化又导致血管弹性差引起高血压。所以，为了降低患这些慢性疾病的概率，人们日益关注声称具有辅助降血压、降血脂以及降血糖的一些三高人群用保健食品。不法分子为了吸引顾客，获得更大的经济利益，铤而走险，在保健食品中违法添加化学药品的现象屡禁不止。目前，我国颁布的打击相应保健食品违法添加化学药品的国家标准都是按单一类别制定。部分熟悉药理药效的高智商不法分子，为了规避相关法规，存在跨适应症违法添加化学药物的情况。如主要适用于降血糖的二甲双胍、格列本脲等临床一线降血糖用处方药，虽被监管部门作为辅助降血糖类保健食品中易违法添加的化学药物而严格监控，但却未收入辅助降血脂类保健食品的易违法添加化学药品目录。二甲双胍、格列本脲等也可以间接缓解血脂浓度，将其违法加入到辅助降血脂类保健食品中，既可以提升功效，又可以规避监管。鉴于上述监管目的，本文将易添加至辅助降血糖、辅助降血脂、辅助降血压类保健食品中的化学药品用同一方法中同时测定，避免漏检，可以在一定程度上扩大对违法添加化学药品的打击面。
目前国家针对辅助降血糖类保健食品中的有3个标准（含13个化学药物），辅助降血脂类保健食品有1个标准（3个化学药物），辅助降血压类保健食品有2个标准（含12个化学药物），6个标准共涵盖28个违法添加化学药物。本文拟将上述6个国家标准中的28个化学药品纳入同一标准进行研究；另参考文献，杜彦山等[3]报道曾检出违法添加的那格列奈，朱青霞等[4]报道曾检出违法添加的盐酸普萘洛尔等，故本文另选取文献报道有检出或者根据药品疗效及可获得性、添加可能性较大的化学药物，总计45个，同时进行测定研究。目前针对违法添加的检测方法主要有薄层色谱法[4-6]、液相色谱法[7-9]、液相色谱质谱联用法[10-13]，由于液相色谱质谱联用法具有较好的定性定量能力，故本文拟建立一个能同时检测高血糖、高血脂、高血压类违法添加化学药物的大容量液相色谱质谱联用方法，并采用该法对300批辅助降血糖、辅助降血脂、辅助降血压类保健食品进行了测定。
1 仪器与试药 1.1 仪器1290型超高效液相色谱仪（安捷伦公司），G6460三重四极杆质谱检测器（安捷伦公司），Agilent Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），Elmasonic P300H超声波清洗器（埃尔玛公司），Delta 320pH计（梅特勒-托利多公司），XPE 205分析天平（精度0.01 mg，梅特勒-托利多公司），Genpure UV/UF超纯水仪（赛默飞科技公司），Multifuge X1高速离心机（赛默飞科技公司）。
1.2 试药对照品格列本脲（批号100135-200404，含量100%）、盐酸二甲双胍（批号100664-201203，含量100.0%）、马来酸罗格列酮（批号100952-200701，含量99.5%）、盐酸苯乙双胍（批号100922-201001，含量99.7%）、格列齐特（批号100269-200603，含量99.9%）、格列吡嗪（批号100281-200602，含量99.4%）、甲苯磺丁脲（批号100500-200801，含量100.0%）、格列美脲（批号100674-201102，含量99.1%）、格列喹酮（批号100280-201002，含量99.3%）、瑞格列奈（批号100753-201102，含量99.7%）、格列波脲（批号520026-201401，含量99.9%）、盐酸吡格列酮（批号100634-201202，含量100.0%）、洛伐他汀（批号100600-200502，含量100%）、辛伐他汀（批号100601-201003，含量99.0%）、阿替洛尔（批号100117-200504，批号100%）、利血平（批号100041-201012，含量99.0%）、盐酸哌唑嗪（批号100164-201003，含量99.0%）、氢氯噻嗪（批号100309-201103，含量99.8%）、硝苯地平（批号100338-201404，含量99.9%）、卡托普利（批号100318-201103，含量99.5%）、盐酸可乐定（批号100071-20110 6，含量99.9%）、尼索地平（批号100574-200401，含量100%）、马来酸氨氯地平（批号100712-200401，含量99.2%）、非洛地平（批号100717-201403，含量99.6%）、尼莫地平（批号100270-201403，含量99.7%）、尼群地平（批号100585-201104，含量99.0%）、那格列奈（批号100619-200501，含量100%）、氟伐他汀钠（批号100800-201302，含量95.5%）、苯扎贝特（批号100732-200501，含量100%）、非诺贝特（批号100733-200401，含量100%）、盐酸普萘洛尔（批号100783-201202，含量100%）、盐酸维拉帕米（批号100223-200102，含量100%）、米诺地尔（批号100238-199701，含量100%）、酒石酸美托洛尔（批号100084-201403，含量99.9%）、厄贝沙坦（批号100607-201202，含量99.8%）、布美他尼（批号100173-2010002，含量99.3%）、盐酸尼卡地平（批号100586-200401，含量99.4%）、盐酸特拉唑嗪（批号100375-200401，含量99.3%）、富马酸比索洛尔（批号100711-200401，含量100%）、替米沙坦（批号100629-201202，含量99.9%）均购于中国食品药品检定研究院，盐酸丁二胍（批号1-RLJ-70-1，含量100%）、去羟基洛伐他汀（批号5-VKU-11-1，含量100%）均购于百灵威科技有限公司，烟酸（批号0001292168，含量99.5%）购于西格玛公司，美伐他汀（批号EBKHK-FE，含量98.0%）购于东京化成工业株式会社，氯磺丙脲（批号30911，含量99.9%）购于Dr.E公司。色谱纯甲醇、乙腈购于默克公司，色谱纯乙酸铵、甲酸购于Sigma公司，分析纯甲醇、乙腈购于国药集团化学试剂有限公司。水为超纯水。300批辅助降血糖、辅助降血脂、辅助降血压类保健食品（含软胶囊、硬胶囊、片剂及颗粒剂等剂型）来源于浙江省内市场抽检样品。
2 方法与结果 2.1 色谱-质谱条件 2.1.1 色谱色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.2 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：1 μL；流动相A：5 mmol·L-1乙酸铵溶液（用甲酸调节pH至3.0）；流动相B：乙腈；梯度洗脱（0~10 min，5%B→40%B；10~15 min，40%B→40%B；15~25 min，40%B→65%B；25~30 min，65%B→95%B；30~31 min，95%B→5%B；31~35 min，5%B→5%B）。
2.1.2 质谱采用ESI源正负离子同时扫描的多反应监测模式，干燥气温度250 ℃，干燥气流量6 L·min-1，鞘气温度350 ℃，鞘气流量11 L·min-1；毛细管电压：+3.5 kV，-4.0 kV；喷嘴电压：+1.5 kV，-1.5 kV。
2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液取格列本脲、盐酸二甲双胍、马来酸罗格列酮、盐酸苯乙双胍、格列齐特、甲苯磺丁脲、格列美脲、格列喹酮、瑞格列奈、格列波脲、盐酸吡格列酮、盐酸丁二胍、洛伐他汀、烟酸、辛伐他汀、美伐他汀、盐酸哌唑嗪、氢氯噻嗪、硝苯地平、卡托普利、盐酸可乐定、尼索地平、马来酸氨氯地平、尼莫地平、那格列奈、氯磺丙脲、氟伐他汀钠、苯扎贝特、非诺贝特、盐酸普萘洛尔、盐酸维拉帕米、米诺地尔、酒石酸美托洛尔、厄贝沙坦、布美他尼、盐酸尼卡地平、盐酸特拉唑嗪、富马酸比索洛尔、替米沙坦的对照品适量，精密称定，用甲醇配制成1.0 mg·mL-1的单标储备溶液；取格列吡嗪、阿替洛尔、利血平、非洛地平、尼群地平的对照品适量，精密称定，用甲醇配制成0.3 mg·mL-1的单标储备溶液；取去羟基洛伐他汀对照品适量，精密称定，用乙腈配制成1.0 mg·mL-1的单标储备溶液。各单标溶液置于-4 ℃冰箱中保存备用。精密吸取各单标储备溶液适量混合，用20%乙腈溶液稀释成系列不同浓度的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液精密称取1次服用量的样品（必要时研细）混匀，置于20 mL量瓶中，加入90%甲醇溶液约15 mL，（37 kHz）10 min后冷却，定容至刻度，过0.22 μm有机滤膜（若为软胶囊样品则用10 000 r·min-1离心10 min后取上清液过滤），待测。若初试为阳性结果样品，则再取样品最小剂量单位5份（必要时研细），混匀，精密称取0.5 g，置于20 mL量瓶中，加入90%甲醇溶液约15 mL，超声（37 kHz）10 min后冷却，定容至刻度（若为软胶囊样品则后续用10 000 r·min-1离心10 min，再取1 mL上清液用20%乙腈溶液稀释后过0.22 μm有机滤膜），待测。
2.3 方法学考察 2.3.1 质谱测定方法取混合对照品溶液，按“2.1”项色谱和质谱条件下进样分析得到总离子流图，各目标物之间分离良好，见图 1。45个目标物的监测离子对及质谱参数见表 1。
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1~45.同表 1（same as Tab. 1） 图 1 45个化学药物线性最高点的总离子流图 Fig.1 The total ion chromatogram of 45 chemical drugs in the highest point of linearity |
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表 1 45个化学药物的质谱测定条件 Tab.1 MS parameters for 45 chemical drugs |
取“2.2.1”项下混合对照品溶液，并按“2.1”项色谱和质谱条件进样分析，以各目标物的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，各目标物的线性回归曲线、线性范围、线性相关系数见表 2。以软胶囊阴性样品作为空白基质，称取约1.0 g，加入混合对照品溶液适量，按“2.2.2”项方法制备溶液，当信噪比为3（S/N=3）时计算方法检测下限，各目标物的检测下限见表 2。
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表 2 45个化合物或目标物的回归方程、线性范围、检出下限及保留时间 Tab.2 Regression equations, linear ranges, LOD and retention times for 45 chemical drugs |
取软胶囊空白基质，分别添加低浓度、中浓度和高浓度的混合对照品溶液，并按“2.1”项色谱和质谱条件下进样分析，连续测定6次，45个目标物峰面积的RSD为0.50%~9.7%。表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验取软胶囊空白基质，分别添加低浓度、中浓度和高浓度的混合对照品溶液，并按“2.1”项色谱和质谱条件在24 h内连续进样分析，峰面积的RSD为1.0%~9.9%。表明24 h内稳定性良好。
2.3.4 回收率试验取软胶囊、片剂、硬胶囊、茶剂空白基质，分别添加低浓度、中浓度、高浓度水平的混合对照品溶液，平行测定3次，45个目标物的回收率为63.3%~129.5%（RSD在0.20%~9.9%），详见表 3均符号要求。
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表 3 45个化学药物的回收率 Tab.3 Recoveries of 45 chemical drugs |
按“2.2.2”项所述对收集到的300批样品进行处理，制备供试品溶液并按“2.1”项色谱和质谱条件进样分析，阳性样品结果见表 4。
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表 4 阳性样品测定结果（mg·g-1） Tab.4 Results of positive samples |
根据相关文献报道，上述目标化合物通常采用反相色谱柱（C18柱）进行分离分析。故本文采用A柱[Agilent Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）]和B柱[Dikma Endeavorsil C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）]进行比较，结果表明：相同浓度的利血平在A柱出峰且响应较好，但在B柱上不出峰，同时使用A柱分离效果良好，故选择A柱。
3.1.2 流动相组成：综合研究结果表明，整体而言，本实验采用乙腈作为有机相时的信号响应比甲醇灵敏，故选用乙腈作为有机相；本实验分析的目标化合物较多，且化合物结构复杂，以纯水作为水相时，目标化合物色谱峰多有拖尾，故通过调节水相中的离子强度来改善峰形；经考察5、10、20 mmol·L-1乙酸铵溶液为流动相时的峰形与灵敏度，当5 mmol·L-1乙酸铵溶液做水相时，目标化合物整体峰形与灵敏度能基本满足测定要求。
pH：水相添加乙酸铵后峰形得到较好的改善，但碱性化合物如盐酸哌唑嗪、盐酸特拉唑嗪、盐酸普萘洛尔等仍拖尾，故调节水相的pH，进一步考察pH为3.0、4.0、5.0的5 mmol·L-1乙酸铵溶液的色谱行为，pH为3.0时峰形尖锐，信号整体较强。故选择乙腈-5 mmol·L-1乙酸铵溶液（用甲酸调节pH至3.0）作为流动相。
3.2 混合对照品溶液的溶剂选择烟酸和盐酸丁二胍出峰时间较早，有机相含量较低，容易出现二次分配：以甲醇作为溶剂时，烟酸峰形分叉；以乙腈作为溶剂时，盐酸丁二胍峰形分叉。比较以20%甲醇溶液与20%乙腈溶液为溶剂时混合对照品溶液的色谱行为，发现20%的甲醇溶液中烟酸依旧分叉，而在20%的乙腈溶液中色谱峰峰形良好，故混合对照品标准溶液用20%的乙腈溶液定容。
3.3 质谱条件的选择本实验所采用的电喷雾离子源可适用于极性小的分子化合物的分析。氢氯噻嗪在负离子模式下易失去氢形成带负电荷的[M-H]-离子[11]，其余目标物均选择正离子。为了提高实验的灵敏度和准确性，先用全扫模式确定母离子，其中洛伐他汀和辛伐他汀的加钠峰的强度强于加氢峰，这与酯键官能团易与钠离子形成加和离子有关，但是加钠峰和加氢峰的裂解方式相同，所产生的碎片离子种类与强度基本一致[12]，故选择加氢峰，接着在SIM模式下对碎裂电压进行优化，最后在PI模式下对碰撞能进行优化，选择2个响应较高且相对分子质量相差大于2（本文实际相差3）的二级离子碎片，其中响应较高的离子作为定量离子。
3.4 样品前处理的优化本实验研究的化合物多数易溶于有机溶剂如甲醇、乙腈等，少数易溶于水但也能溶于有机溶剂。考察50%甲醇溶液和50%乙腈溶液的提取效率，发现50%甲醇溶液提取效果较好，接着考察10%、30%、50%、70%、90%的甲醇溶液，整体上90%甲醇溶液提取效果较好。最后对超声时间进行优化，超声（37 kHz）10 min时提取效果较好。同时，由于软胶囊中的油脂不溶于90%的甲醇溶液，超声处理后会形成乳浊液，且能通过0.22 μm滤膜，但经10 000 r·min-1离心后油脂能沉淀在底部，故对于软胶囊样品定容后需要用10 000 r·min-1离心10 min。由于软胶囊样品与其他样品的前处理方式不同，故选用软胶囊空白基质来做检测下限。若初试为阳性结果样品，考虑到其可能是由于上个样品的残留，此外样品个体之间也有差异，为了更好地定量，则取样品最小剂量单位5份，必要时研细，混匀后进行下一步处理。
3.5 含量测定结果分析300批样品测定的结果显示共有3批阳性样品，其中1批违法添加氢氯噻嗪和氨氯地平，1批违法添加格列本脲，1批违法添加格列本脲和苯乙双胍。
3.6 小结本文建立的方法可同时测定三高人群用保健食品中违法添加的45个化学药物，并涵盖28个现有国家标准规定检测的目标化合物。本法检出容量较大，可以在一定程度上避免违禁药物的漏检，适用范围更广，具有较好的应用前景。
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