2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
蚓激酶（lumbrokinase）是从人工饲养的赤子爱胜蚓中分离纯化出的纤溶酶（酸性蛋白质），能在生理条件下将血液中的纤维蛋白直接降解以及将纤溶酶原激活为纤溶酶，加速血栓的溶解。蚓激酶为抗血栓药，临床上主要用于缺血性脑血管病，使过高的纤维蛋白原和血小板凝集率降低。1992年，蚓激酶作为药物在我国上市，目前，国内共有5家蚓激酶原料及制剂生产企业，均以赤子爱胜蚓为原材料，整体加水磨浆，离心，上清液经过阴离子纤维素交换层析纯化而成[1-2]。
文献查阅发现，不同的有害元素对蚓激酶活性产生不同程度的影响，如铅（Pb）、铜（Cu）元素会严重影响蚓激酶活性[3-4]。同时有害元素难以被生物降解，却能与酶或蛋白质结合，在食物链的生物放大作用下，成千百倍地富集，最后进入人体，严重损害人体的新陈代谢和正常的生理功能[5]。故有必要监测并考察蚓激酶中有害元素的残留量，对保证蚓激酶的质量安全具有十分重要的意义。
本文采用微波消解-电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法[6-11]建立测定蚓激酶中铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、钴（Co）、镍（Ni）、铜（Cu）、砷（As）、银（Ag）、镉（Cd）、锑（Sb）、钡（Ba）、汞（Hg）、铊（Tl）、铅（Pb）等14个有害元素含量的方法，以期为该原料药的质量控制提供参考。
1 仪器与试药 1.1 仪器CEM MARS-xpress微波消解仪（CEM公司）；Agilent 7700X电感耦合等离子体质谱仪（安捷伦科技有限公司）；Synergguvmillipore超纯水制水机（密理博中国有限公司）；博通GST25-20A赶酸仪（上海博通化学科技有限公司）。
1.2 试剂与对照品硝酸（Fluka，批号BCBP0680V）、超纯水（由超纯水制水机制得），内标对照品溶液（ICP-MS Internal Std Mix，含Bi、Ge、In、Rh、Sc等内标元素，质量浓度100 μg·mL-1，安捷伦科技股份有限公司）。
混合对照标准溶液（包含Pb、As、Cd、Cr、Cu、Ag、Mn、Tl、Ba、Co、Ni、Sb等元素，质量浓度均为10 μg·mL-1；Fe元素质量浓度为1 000 μg·mL-1，安捷伦科技有限公司）；Hg单元素标准溶液（质量浓度1 000 μg·mL-1，中国计量科学研究院）。
1.3 样品信息蚓激酶原料药共10批次（批号1405、1406、1407、1409、1506、1507、1508、1510、1610、1611），均由A公司提供；蚯蚓培养土壤样品4批，均为同一日期，在蚯蚓培养基地中随机抽取4块培养田分别取土壤样本，土壤样本阴干后，105 ℃干燥，过筛弃去沙石和异物（5号筛，80目），即得。编号分别为土壤1~4。
2 方法与结果 2.1 试验条件 2.1.1 ICP-MS条件射频功率：1 530 W；冷却温度：4 ℃；碰撞气：氦气；载气：氩气；载气流量：1.08 L·min-1；积分时间：0.3 s；等离子气流量：15 L·min-1；四极杆真空度：3.04×10-4 Pa；采样锥孔径：1.0 mm；截取锥孔径：0.4 mm；数据采集重复次数：3次；入口温度：33.8 ℃；出口温度：41.5 ℃。
2.1.2 微波消解程序消解功率为1 600 W，30 min内由室温升温至160 ℃，保持5 min，再以5 ℃·min-1升温至190 ℃，保持45 min。
2.2 测定法测定时选取的同位素为52Cr、55Mn、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、75As、107Ag、111Cd、121Sb、137Ba、202Hg、205Tl、208Pb，其中52Cr、55Mn、56Fe以45Sc作为内标，59Co、60Ni、63Cu、75As以72Ge作为内标，107Ag以103Rh作为内标，111Cd、121Sb、137Ba以115In作为内标，202Hg、205Tl、208Pb以209Bi作为内标。仪器的内标进样管在仪器分析过程中始终插入内标溶液中，依次将仪器的样品管插入系列混合对照溶液中进行测定，以测量值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。之后将仪器的样品管依次插入样品溶液中，测定，从标准曲线上计算得相应的浓度。在同样的分析条件下进行空白试验进行空白校正。
2.3 溶液的制备 2.3.1 混合内标溶液（1 μg·mL-1）精密量取内标对照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用2%硝酸稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3.2 Hg单元素标准储备液（10 μg·mL-1）精密量取Hg单元素标准溶液（1 000 μg·mL-1）1 mL，置100 mL量瓶中，用2%硝酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3.3 混合对照溶液精密量取混合对照标准溶液10 mL，置100 mL量瓶中，精密加入Hg单元素标准储备液（10 μg·mL-1）1 mL，用2%硝酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得混合对照储备液（Fe元素质量浓度为100 μg·mL-1，Hg元素质量浓度为100 ng·mL-1，其余待测元素质量浓度为1 μg·mL-1），精密量取0、0.05、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0、25.0 mL，分别置50 mL塑料量瓶中，用2%硝酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得系列浓度（详见表 1）的混合对照溶液。
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表 1 混合对照溶液浓度 Tab.1 Concentration of mixed reference solution |
精密称取蚓激酶样品0.5 g，置微波消解罐中，精密加入硝酸8 mL，100 ℃赶酸仪中预消解1 h，盖好内盖，旋紧外套，置于微波消解仪中，按“2.1”项下微波消解程序进行消解，放冷，110 ℃赶酸仪中加热至红棕色蒸气挥尽，并继续挥发硝酸至样品约0.5 mL，放冷，用水转移至25 mL塑料量瓶并稀释至刻度，摇匀，即得。同法制备样品空白溶液，对蚓激酶样品溶液做空白校正。
2.3.5 蚯蚓培养土壤样品溶液精密称取蚯蚓培养土壤样品0.1 g，置微波消解罐中，精密加入硝酸8 mL及氢氟酸0.5 mL，100 ℃赶酸仪中预消解1 h，盖好内盖，旋紧外套，置于微波消解仪中，按“2.1”项下微波消解程序进行消解，放冷，110 ℃赶酸仪中加热至红棕色蒸气挥尽，并继续挥发硝酸至样品约0.5 mL，放冷，用水转移至100 mL塑料量瓶并稀释至刻度，摇匀，精密量取25 mL，置50 mL塑料量瓶中，用2%硝酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为Cr、Co、Ni、Cu、As、Ag、Cd、Sb、Hg、Tl、Pb元素测定样品溶液；精密量取5 mL，至25 mL塑料量瓶中，用2%硝酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为Mn、Fe、Ba元素测定样品溶液。同法制备样品空白溶液，对蚯蚓培养土壤样品溶液做空白校正。
2.4 线性关系考察取混合内标溶液与混合对照溶液, 按“2.1”项下ICP-MS条件同时进样测定，记录仪器响应值（CPS）。以混合对照溶液质量浓度（X，ng·mL-1）为横坐标，仪器响应值（Y）为纵坐标进行线性回归，回归方程、线性范围详见表 2。
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表 2 回归方程、线性范围与检测下限 Tab.2 Regression equations, linear ranges and detection limits |
取“2.3”项下空白样品溶液适量，按“2.1”项下试验条件连续进样测定11次，计算仪器响应值的标准偏差，3倍标准偏差对应的各待测元素质量浓度即为检测下限，详见表 2。
2.6 精密度试验取“2.3.3”项下混合对照溶液C7，按“2.1”项下试验条件连续进样测定6次，记录仪器响应值。结果Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、As、Ag、Cd、Sb、Ba、Hg、Tl、Pb各元素响应值的RSD（n=6）分别为0.62%、1.3%、0.59%、0.59%、0.86%、1.1%、1.7%、1.0%、1.1%、0.58%、0.79%、0.93%、1.4%、1.2%，表明仪器精密度良好。
2.7 重复性试验称取同一批样品（批号1611）约0.5 g，精密称定，共取6份，按“2.3”项下方法制备样品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录仪器响应值。结果，6份样品中Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、As、Ag、Cd、Sb、Ba、Hg、Tl、Pb各元素平均含量（n=6）分别为0.6、19.8、139.0、0.7、5.7、7.6、0.8、0.01、1.2、0.06、4.2、0.02、0.002、0.3 μg·g-1，RSD分别为0.86%、0.71%、0.81%、0.87%、0.86%、0.66%、1.3%、2.4%、1.3%、2.9%、1.4%、5.0%、7.6%、0.70%，表明本方法重复性良好。
2.8 稳定性试验取“2.3”项下蚓激酶样品溶液（批号1611）适量，分别于室温下放置0、4、8、12、16、20、24 h进样测定，记录仪器响应值。结果Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、As、Ag、Cd、Sb、Ba、Hg、Tl、Pb各元素响应值的RSD分别为3.9%、1.9%、2.8%、4.4%、1.6%、2.5%、4.4%、4.9%、3.1%、5.0%、2.4%、5.4%、8.2%、2.9%，表明样品溶在24 h内稳定性良好。
2.9 加样回收率试验 2.9.1 蚓激酶称取同一批样品（批号1611）约0.5 g，精密称定，共取9份，分别精密加入“2.3.3”项下混合对照储备液0.5、0.5、0.5、1.0、1.0、1.0、1.5、1.5、1.5 mL，按“2.3.4”项下方法制备Cr、Fe、Co、As、Ag、Cd、Sb、Ba、Hg、Tl、Pb元素加样回收溶液；称取同一批样品（批号1611）约0.5 g，精密称定，共取9份，分别精密加入“2.3”项下混合对照储备液0.15、0.15、0.15、0.25、0.25、0.25、0.5、0.5、0.5 mL，按“2.3”项下方法制备Mn、Ni、Cu元素加样回收溶液；再按“2.1”项下试验条件进样测定，计算各待测元素的量并计算加样回收率，结果详见表 3。
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表 3 蚓激酶样品中各元素回收率试验结果 Tab.3 Results of recovery test of elements in lumbrokinase |
称取同一批样品（土壤1）约0.1 g，精密称定，共取9份，分别精密加入混合对照标准溶液0.2、0.2、0.2、0.4、0.4、0.4、0.6、0.6、0.6 mL，分别精密加入Hg单元素标准储备液（10 μg·mL-1）0.05、0.05、0.05、0.10、0.10、0.10、0.15、0.15、0.15 mL，按“2.3.5”项下蚯蚓培养土壤样品溶液制备方法制备Cr、Co、Ni、Cu、As、Ag、Cd、Sb、Hg、Tl、Pb元素加样回收溶液；称取同一批样品（土壤1）约0.1 g，精密称定，共取9份，分别精密加入混合对照标准溶液1.0、1.0、1.0、2.0、2.0、2.0、3.0、3.0、3.0 mL，按“2.3”项下蚯蚓培养土壤样品溶液制备方法制备Mn、Fe、Ba元素加样回收溶液；再按“2.1”项下试验条件进样测定，计算各待测元素的量并计算加样回收率，结果详见表 4。
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表 4 土壤样品回收率试验结果 Tab.4 Results of recovery test of soil |
蚓激酶原料药：称取样品约0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备样品溶液，再按“2.1”项下条件进样测定，每批次样品平行测定2份，计算样品有害元素含量，结果见表 5。
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表 5 蚓激酶样品中元素的测定结果（μg·g-1，n=2） Tab.5 Determination results of harmful elements in lumbrokinase |
土壤样品：称取样品约0.1 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备样品溶液，再按“2.1”项下条件进样测定，每批次样品平行测定2份，计算样品中有害元素含量，结果见表 6。
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表 6 土壤样品中有害元素的测定结果（μg·g-1，n=2） Tab.6 Determination results of harmful elements in soil |
为方便比较蚓激酶原料与土壤中14种有害元素的分布特征，以有害元素为横坐标，以10批次蚓激酶原料药中有害元素含量平均值的自然对数值及4批次土壤中有害元素含量平均值的自然对数值为纵坐标，绘制元素含量特征分布图（图 1）。
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图 1 元素含量特征分布图 Fig.1 Feature distribution diagram of elements |
本研究10批次蚓激酶原料药样品从生产日期远近比较，同一年份生产的样品有害元素含量很接近，不同年份的样品有害元素的含量虽大体接近，但还是有细微差别：比如Fe、Mn元素含量从2014年到2016年呈现递增的关系；Ni、As元素含量从2014年到2015年均降低近1倍。从单个元素分析，蚓激酶原料药中有害元素Fe含量较高（70~140 μg·g-1），Mn、Ni、Cu含量次之（8.0~20 μg·g-1），其余有害元素含量均低于5.0 μg·g-1。《中华人民共和国药典》2015年版对中药材及中药饮片中有害元素和有害元素限度标准[12]：Pb不得过5 μg·g-1，Cd不得过0.3 μg·g-1，Hg不得过0.2 μg·g-1，Cu不得过20 μg·g-1，As不得过2 μg·g-1。10批次样品中Pb、Hg、Cu元素含量均在参考限度内；有3批次样品中As元素含量超出参考限度；10批次样品中Cd元素含量均超出参考限度。样品中含量较高的Fe、Mn元素参考《中国居民膳食营养素参考摄入量》[13]中相应的可耐受最高摄入量（UL）的规定：Fe不得过42 mg·d-1；Mn不得过11 mg·d-1。按蚓激酶制剂说明书中用法用量要求折算，蚓激酶日口服量约为150 mg计算，10批次样品中Fe、Mn元素含量均在参考限度内。
元素含量特征分布图（图 1）结果显示，样品中各有害元素含量比例与蚯蚓培养土壤中各有害元素含量比例接近，说明蚓激酶的生产从蚯蚓养殖到蚓激酶的提取净化过程存在有害元素迁移的可能，结果提示企业应更多关注对原材料（蚯蚓）养殖环境的监测。
回收率试验结果显示，各元素加样回收率均较理想，表明样品中基质对各元素干扰较小，但待测元素中Hg元素不稳定，样品溶液放置过久易造成Hg元素测定值偏低；稳定性试验显示，样品溶液在24 h内稳定，故建议样品溶液制备后当日测定，或在样品溶液中加入适量金（Au）元素标准溶液，使Hg元素与Au元素形成稳定的金汞合物，保证Hg的稳定性[12]。微波消解法作为样品前处理，不仅耗时少，耗酸量小，而且能保证样品充分消解；ICP-MS可同时测定多种金属元素，灵敏度高，精密度好，是分析金属元素的尖端仪器。方法学评价显示，此方法线性回归良好，灵敏度高，准确性好，适用于蚓激酶中有害元素的检测分析。
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