2019, Vol. 39 
2. 河南中医药大学河南省呼吸病协同创新中心, 郑州 450046
2. Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province, Zhengzhou 450046, China
补肺益肾方为河南中医药大学第一附属医院临床验方，由人参、黄芪、酒萸肉、枸杞子、醋五味子、炙淫羊藿、浙贝母、陈皮、矮地茶、炒紫苏籽、赤芍、地龙12味中药组成，具有补肺益肾、益气化痰、止咳平喘等功效，在治疗慢性阻塞性肺炎（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）疾病方面具有显著的临床疗效。前期研究表明补肺益肾方在调节肺泡表面活性蛋白进而维持肺泡结构稳定[1]，调节气道慢性炎症的进程[2-3]，纠正肺脏炎症信号通路[4]，抑制COPD炎症反应[5]，延缓COPD气道重塑[6-9]，改善T淋巴细胞亚群，调节机体免疫功能[10-13]，改善COPD氧化应激状态[14]等方面效果显著，可以有效缓解COPD患者肺功能下降，减少急性加重发作次数和程度[15]；改善慢阻肺疾病稳定期患者的活动耐力和生活质量[16-17]。在治疗COPD疾病方面极大的减轻患者痛苦，延长患者的生命，提高患者生存质量，且其远后效应显著，具有较大二次开发的潜力。
超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）因为具有快速、准确、灵敏等特点，对于中药物质尤其是微量成分的鉴定和检测速度得到了很大的提升，在血清化学成分的鉴定及定量中起到不可替代的作用。张爱华等[18]采用UPLC-MS方法对男仕胶囊进行研究，发现其血清化学显性成分对肾阳虚大鼠的代谢轮廓有较大改善，并进行相应的含量测定。王喜军等[19]采用UPLC-MS方法对茵陈蒿汤进行研究，发现其血清化学显性成分对肝损伤大鼠的代谢轮廓有较大改善，并进行相应的含量测定。血清药物中的显性成分越来越多的被中药学家作为含量测定的指标性成分进行检测，并已经成为研究中药复方药效物质基础的主流方法。目前已有学者应用液相色谱质谱联用技术同时测定参芍胶囊[20]、复方苦参汤[21]、回春育子颗粒[22]等中药成分的含量，为本研究测定补肺益肾方中入血成分的含量提供了参考。
本研究应用UPLC-QE-Orbitrap-MS法检测补肺益肾方的血浆入血成分，并以其中10个为指标建立补肺益肾方中的含量测定方法，为今后该药建立全面的质量控制及定量研究提供了更为科学的数据，这对中药更好地发挥临床疗效具有深远的意义及应用价值。
1 仪器与试药 1.1 仪器Thermo Scientific Q Exactive台式四极杆-轨道阱高分辨质谱仪（Thermo Scientific公司），Xcalibur质谱工作站（Thermo Scientific公司）；UltiMate 3000高效液相色谱仪（Thermo Scientific公司）；Phenomenex kinetex C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；Milli-Q处理纯净水（Millipore公司）；十万分之一电子天平（METTLER TOLEDO公司）。
1.2 试药对照品人参皂苷Re、Rb1、Rg1及贝母素甲、五味子乙素、黄芪甲苷、淫羊藿苷、橙皮苷、川陈皮素、芍药苷（分析纯，98%，四川维克奇生物科技有限公司）；补肺益肾颗粒（10 g·袋-1，批号20180426、20180518、20180603）由国家中医临床研究基地河南中医药大学第一附属医院临床药理研究基地提供。超纯水（自制）；乙腈，甲醇，甲酸（色谱纯，Fisher Scientific，赛默飞世尔科技有限公司）。
2 方法与结果 2.1 入血成分的确定 2.1.1 含药血浆的处理SD雄性大鼠，随机分为给药组和空白组，每组6只，给药剂量以60 kg成人计大鼠等效计量的10倍，药物溶于1%羧甲基纤维素钠溶液，空白组给予等量的1%羧甲基纤维素钠溶液，连续给药7 d，末次给药前12 h禁食但不禁水，给药后2 h腹主动脉取血，室温静置1 h，3 000 r·min-1离心15 min，分离血浆，取血浆样品100 μL，3倍量甲醇沉淀蛋白，涡旋120 s，12 000 r·min-1离心10 min，上清液用氮吹仪吹干，残渣用100 μL的50%甲醇复溶，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，进样。
2.1.2 血浆样品的测定及结果采用Phenomenex kinetex C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~2 min，5% B；2~12 min，5% B→100% B，12-15 min，100% B），流速0.3 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量5 μL。应用ESI离子源，正负切换全扫模式采集数据；应用Xcalibur软件以精确m/z提取离子峰以确定保留时间；应用Mass Frontier 6.0工作站匹配特征碎片离子，鉴别化合物结构，确定入血成分，结合文献对各成分的药效报道最终选定人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、黄芪甲苷、贝母素甲、五味子乙素、淫羊藿苷、橙皮苷、川陈皮素、芍药苷10个为药物入血的有效成分，10个成分定性鉴别结果见表 1。
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表 1 10个化学成分鉴定结果 Tab.1 Identification results of 10 components |
取质量浓度为0.05 μg·mL-1混合对照品溶液20 μL加入空白血浆100 μL中，制得对照品血浆；分别取空白血浆、含药血浆以及对照品血浆各100 μL，按照“2.1.1”项下方法处理，按照“2.1.2”项下方法测定，结果见图 1。结果显示各成分峰形良好，空白无干扰。
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图 1 对照品（a）、给药血浆（b）、空白血浆（c）各成分UPLC-MS/MS色谱图 Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms of reference substances(a), administration plasm(b)and blank plasm(c) |
分别精密称取对照品人参皂苷Re、Rb1、Rg1及黄芪甲苷、贝母素甲、五味子乙素、淫羊藿苷、橙皮苷、川陈皮素、芍药苷适量，以甲醇配制得1 mg·mL-1的各单一成分对照品溶液。分别移取计算量的单一成分对照品溶液，用50%甲醇水配制成人参皂苷Re 1.042 μg·mL-1、人参皂苷Rb1 1.405 μg·mL-1、人参皂苷Rg1 1.223 μg·mL-1、黄芪甲苷1.024 μg·mL-1、贝母素甲1.240 μg·mL-1、五味子乙素1.262 μg·mL-1、淫羊藿苷1.124 μg·mL-1、橙皮苷10.80 μg·mL-1、川陈皮素1.366 μg·mL-1、芍药苷10.62 μg·mL-1的混合溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液的制备精密称取一定量补肺益肾方颗粒，按照1:500的比例加入50%（v/v）甲醇水，称量，超声60 min，取出冷却至室温，50%甲醇水补足减失的量，摇匀，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.2.3 色谱条件同“2.1.2”。
2.2.4 质谱条件电喷雾离子化源（ESI），载气为氮气，鞘气压力3.5 MPa，辅助气流速3.3 L·min-1，喷雾电压3.50 kV（+），透射电镜120 V。毛细管温度350 ℃，辅助气加热温度200 ℃，分辨率为70 000，扫描方式为全扫模式，正、负离子切换模式测定，质量扫描范围m/z 100~1 500。各成分提取离子流图见图 2。
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图 2 对照品（a）、补肺益肾方样品（b）的各成分UPLC-MS/MS色谱图 Fig.2 UPLC-MS/MS chromatograms of reference substances(a)and Bufeiyishen sample(b) |
精密吸取混合对照品溶液适量，加50%甲醇稀释成7个浓度梯度的系列混合对照品溶液，依照“2.2.3”项下条件进行测定，以浓度X为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线。10个成分的线性范围、回归方程、相关系数见表 2。结果表明各成分线性范围内具有良好的线性关系。
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表 2 10个成分的线性范围、回归方程 Tab.2 Linear ranges, regression equation of 10 components |
将混合对照品溶液逐步稀释，进样测定，以信噪比为3:1为检测下限，10:1为定量下限。人参皂苷Re、Rb1、Rg1、黄芪甲苷、贝母素甲、五味子乙素、淫羊藿苷、橙皮苷、川陈皮素、芍药苷10个成分检测下限分别为0.008、0.028、0.008、0.011、0.025、0.077、0.010、0.012、0.007、0.030 ng·mL-1；定量下限分别为0.026、0.096、0.024、0.039、0.076、0.212、0.033、0.381、0.027、0.101 ng·mL-1。
2.2.7 精密度试验取混合对照品溶液，连续进样6次，人参皂苷Re、Rb1、Rg1及黄芪甲苷、贝母素甲、五味子乙素、淫羊藿苷、橙皮苷、川陈皮素、芍药苷10个成分峰面积的RSD分别为2.5%、1.9%、2.1%、2.3%、2.2%、2.2%、2.4%、2.5%、1.7%、2.2%，仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性试验取同一供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12 h分别进样5 μL进行测定。结果人参皂苷Re、Rb1、Rg1及黄芪甲苷、贝母素甲、五味子乙素、淫羊藿苷、橙皮苷、川陈皮素、芍药苷10个成分峰面积的RSD分别为2.7%、1.8%、2.5%、2.8%、2.2%、2.5%、2.4%、1.9%、2.3%、2.2%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.2.9 加样回收率试验取已知含量的样品（批号20180426）各9份（针对黄芪甲苷5 g、橙皮苷、芍药苷0.1 g、川陈皮素2 g、其他成分0.5 g），分别按已知量的80%、100%、120%加入对照品溶液，依照“2.2.2”项下方法制备供试溶液，进样测定，计算各成分的平均加样回收率，结果人参皂苷Re、Rb1、Rg1及黄芪甲苷、贝母素甲、五味子乙素、淫羊藿苷、橙皮苷、川陈皮素、芍药苷加样回收率分别为97.2%、96.7%、96.0%、99.8%、104.0%、97.8%、100.6%、98.7%、93.7%、98.0%，RSD分别为2.1%、2.6%、3.1%、3.4%、2.8%、2.0%、2.4%、3.6%、4.1%、2.7%，表明该方法加样回收率良好。
2.2.10 样品的测定分别取20180426、20180508、20180603批补肺益肾方颗粒，依照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液制备方法依照“2.2.3”和“2.2.4”项下条件进行10个成分的含量测定，结果如表 3。
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表 3 样品测定结果（mg·g-1，n=3） Tab.3 Results of sample analysis |
补肺益肾方中含有12味中药，所含化学物质复杂多样，采用血浆药物化学研究方法，应用UPLC-QE-Orbitrap-MS技术分析空白血浆和含药血浆，寻找药物入血成分，通过对入血成分进行分析最终确定与治疗COPD疾病显著相关的10个原型入血成分，并对其进行含量测定。
橙皮苷和芍药苷在处方中虽然含量较高，但二者在血浆中原型成分较难检测，此外方法学考察结果表明测定误差均在定量测定允许范围内，目前止痒乳膏[21]、一清胶囊[22]、参芍胶囊[23]中含量较高成分亦基于LC-MS法进行含量测定，因此本文处方中橙皮苷和芍药苷的测定也选用LC-MS法测定含量。
3.2 质谱条件的选择本研究通过对10个成分进行正负切换全扫模式测定发现人参皂苷、芍药苷、淫羊藿苷、橙皮苷和黄芪甲苷在负离子模式下响应较好，其中人参皂苷Re、Rg1、Rb1及芍药苷、淫羊藿苷、黄芪甲苷加合离子峰为[M+HCOO]-，m/z分别为991.548 3、845.490 4、1 153.601 1、525.161 4、721.134 9、829.459 1；橙皮苷加合离子峰为[M-H]-，m/z为609.182 5；川陈皮素、五味子乙素、贝母素甲在正离子下具有较好的响应，加合离子峰为[M+H]+，m/z分别为403.137 0、401.195 9、432.347 2；因此研究中应用正负切换全扫模式采集数据。
3.3 色谱条件的选择色谱条件考察了流动相系统对实验测定分离效果的影响。本研究分析了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液3个不同流动相系统对各成分的分离效果。结果发现乙腈和甲醇相比，乙腈具有较强的洗脱能力，各成分出峰较快；水与0.1%甲酸水溶液相比，0.1%甲酸水溶液系统可以改善峰型且分离度较好；故本研究选择乙腈-0.1%甲酸水溶液流动相系统，各成分较快出峰，分离度和峰形较好，适用于本研究各成分的分析。
3.4 血浆样品制备条件的考察血浆样品的制备应用蛋白沉淀的方法，考察了甲醇、乙腈、乙醇沉淀溶剂，及100%甲醇、70%甲醇水、50%甲醇水不同复溶溶剂，结果发现以甲醇为沉淀蛋白的溶剂，以50%甲醇水为复溶溶剂，各成分峰形较好，响应度高，适于该研究中血浆样品的制备。
3.5 供试品溶液的制备在供试品溶液的制备过程中考察了50%甲醇水、70%甲醇水、100%甲醇不同提取溶剂，结果显示50%甲醇水作为提取溶剂各成分分离效果好，含量较高，故本研究选择50%甲醇水作为提取溶剂。
3.6 小结本研究建立了UPLC-QE-Orbitrap-MS法测定补肺益肾方中有效成分的含量测定方法，方法灵敏、准确、高效；该质谱方法的建立为该方的质量控制及后续的体内药代动力学分析提供了稳定可靠的方法，具有较为深远的意义和应用价值。
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