2019, Vol. 39 
血竭有“活血圣药”的美誉，主要由棕榈科植物麒麟竭(Daemonorops draco BL.)的树脂加工而成，多产于印度尼西亚，也称为进口血竭[1]。20世纪70年代，我国著名草药学家谢宗万先生发现了百合科龙血树属植物剑叶龙血树[Dracaena cochinchinensis (Lour.) S.C. Chen]，从其含脂木材中经乙醇提取而得到的树脂为龙血竭，也称作国产血竭[2]。2种“血竭”均有一定的活血化瘀作用，疗效却不尽相同，国产血竭尚不能够完全代替进口血竭[3]。国产血竭与进口血竭基原植物不同，所含化学成分差异较大，临床不应将两者混用。近年来，研究表明[4-6]，中药材的药效发挥不仅与有机化学成分有关，而且与其含有的微量元素密切相关。大量实验证明[7-9]，中药活血化瘀功效多与药材中Fe、Cu、Zn、Mg、Ca、Sr、K、Pb、Cd、Cr等微量元素分布及相互作用有关，分析这些微量元素的分布规律和相关性对2种“血竭”的比较研究具有参考意义，目前尚未有对2种“血竭”药材中微量元素测定及比较分析的报道。
常用微量元素检测方法[10-12]包括原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、离子色谱法等，其中原子吸收光谱法[13]被《中华人民共和国药典》2015年版收载，具有灵敏度高、操作方便、成本较低的优势，适合推广应用。本研究通过微波消解法处理药材样品，采用火焰原子吸收法(FAAS法)和石墨炉原子吸收法(GFAAS法)测定国产血竭、进口血竭中10种微量元素含量，进一步利用Radar图分析法[14]和Spearman等级相关系数[15]研究各元素的分布规律和相关性，为2种“血竭”的临床使用和药效研究提供参考。
1 材料 1.1 药材样品收集国产血竭、进口血竭药材样品共20批次，分别来源于广西、河北、安徽、内蒙古、甘肃、贵州、北京和新加坡等地的药店或药市(表 1)。所有药材均由北京中医药大学中药资源与鉴定系石晋丽教授鉴定。
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表 1 药材样品信息 Tab.1 The sampling information of Draconis Resina and Draconis Sanguis |
TAS-990 Super型原子吸收光谱仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；MDS-6型微波消解仪(杭州诺丁科学器材有限公司)；MS105DU型电子分析天平(梅特勒公司)；PME0438-035型空气压缩机(德国KNF公司)；CSR-1-10(Ⅱ)超纯水机(北京博峰天成科技有限公司)；Cu、Fe、K、Ca、Mg、Sr、Zn、Pb、Cr、Cd空心阴极灯(北京曙光明电子公司)。
1.2.2 试剂浓硝酸、过氧化氢为优级纯；实验用水均为超纯水(18.2 MΩ)；Cu、Fe、K、Ca、Mg、Sr、Zn、Pb、Cr、Cd标准储备液购买于中国计量科学研究院，规格20 mL，质量浓度1 000 μg·mL-1。
2 方法 2.1 样品预处理精密称取药材样品0.5 g置于四氟乙烯消解罐中，加入4 mL浓HNO3、2 mL H2O2浸泡过夜后，按压力主控程序(程序1：压力0.3 mPa，5 min；程序2：压力0.8 mPa，3 mim；程序3：压力1.0 mPa，3 min；程序4：压力1.4 mPa，5 min；程序5：压力1.7 mPa，5 min；程序6：压力2.0 mPa，5 min)进行微波消解。消解完全后，取消解内罐置电热板上缓缓加热至红棕色蒸汽挥尽，并浓缩至2~3 mL，放冷，超纯水定量转移至25 mL量瓶中，即得样品溶液。空白溶液同步配制。
2.2 仪器方法采用空气-乙炔火焰原子吸收法测定样品中Cu、Fe、K、Ca、Mg、Sr、Zn 7种元素含量，优化仪器测定参数，工作参数见表 2。采用石墨炉原子吸收法测定样品中Pb、Cr、Cd 3种元素含量，进样量为10 μL，优化后的石墨炉程序见表 3。在上述仪器条件下测定空白溶液，采用自吸校正背景系统扣除背景干扰。在测定Ca的含量时，通常基体中共存的Al、Si、P等元素会对Ca的测定产生较大的化学干扰，本实验在待测样品中加入少量掩蔽剂氯化镧溶液以消除干扰。
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表 2 火焰原子吸收法仪器工作条件 Tab.2 Working conditions of flame atomic absorption spectrometry |
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表 3 石墨炉原子吸收法仪器工作条件 Tab.3 Working conditions of graphite furnace atomic absorption spectrometry |
分别移取不同体积的Cu、Fe、K、Ca、Mg、Sr、Zn、Pb、Cr、Cd的标准储备液于100 mL量瓶中，以2%硝酸水溶液定容，配制成一系列不同浓度的标准溶液，按照表 2和表 3仪器工作条件测定标准溶液中10种元素吸收度，以浓度和吸收度绘制标准曲线。取空白溶液连续测定5次，以3倍空白溶液的标准偏差所对应的浓度作为仪器检测下限。得到各元素的回归方程、线性范围、相关系数r2和检测下限，见表 4所示。
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表 4 10种元素的回归方程、线性范围、相关系数和检测下限 Tab.4 The regression equations, linear ranges, correlation coefficients and detection limit of 10 elements |
分别按照优化的光谱仪工作条件，取S-1样品溶液，连续进样6次进行测定。得到各元素吸收度的RSD范围为0.31%~1.5%，结果表明原子吸收光谱仪精密度良好。
2.4.2 重复性取同一批血竭样品(S-1)，按照样品溶液制备方法平行制备6份溶液，在仪器工作条件下依次测定，各元素RSD范围为0.25%~1.86%，结果表明该方法重复性良好。
2.4.3 稳定性将制备好的同一样品(S-1)的溶液，保存于0~4 ℃环境中，分别于0、2、4、8、12、16、24 h后按上述方法测定，各元素的吸收度RSD范围为0.42%~ 1.9%，结果表明各元素在24 h内稳定性良好。
2.4.4 加标回收率分别取已知元素含量的样品S-1共6份，加入各标准溶液适量，分别按上述样品制备方法和条件进行测定，结果见表 5，表明实验所用方法对各元素回收率较高。
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表 5 加标回收率试验结果(n=6) Tab.5 Test results of spiked recovery |
按照“2.1”项方法制备样品溶液，采用火焰原子吸收法测定样品中Cu、Fe、K、Ca、Mg、Sr、Zn元素含量；用移液枪精密吸取样品20 μL注入石墨炉原子化器，测定Pb、Cr、Cd吸光度，所有样品平行测定3次，计算药材中各元素含量，结果见表 6。我国《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》限量规定，重金属元素Cr量≤3 mg·kg-1、Pb量≤5 mg·kg-1、Cd量≤0.3 mg·kg-1。本研究结果发现，相关各元素含量均低于行业标准，符合规定。
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表 6 样品中各元素含量测定结果(μg·g-1，n=3) Tab.6 Determination results of elements in samples |
国产血竭和进口血竭中各元素之间含量相差较大，含量测定数据通过Radar图分析方法进行分层处理。得到3个层次Radar分析图，见图 1：Fe、K、Ca元素(0~4 000 μg·g-1)Radar 1图；Cu、Mg、Sr、Zn元素(0~140 μg·g-1)Radar 2图；Pb、Cr、Cd重金属元素(0~0.1 μg·g-1)Radar 3图。Radar分析图中左侧为国产血竭样本R-1~R-9，右侧为进口血竭样本S-1~S-11，元素分布远离雷达中心，代表在该分布层次中含量越高。研究分析发现，药效相关元素中，Fe、K、Ca在2种血竭中分布最为广泛(0~4 000 μg·g-1)，进口血竭含量均高于国产血竭。Cu、Mg、Sr、Zn分布次之(0~140 μg·g-1)，进口血竭中Mg、Cu含量高于国产血竭，而Sr、Zn含量低于国产血竭。国产血竭中含有较高的重金属元素Cr，重金属Pb、Cd元素在2种血竭中分布相当(0~0.10 μg·g-1)。
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图 1 国产血竭(R)、进口血竭(S)中10种微量元素Radar分布图 Fig.1 Radar charts of 10 trace elements in Draconis Resina and Draconis Sanguis |
采用SAS 9.2软件进行各元素间相关性分析，国产血竭、进口血竭药材样本元素含量测定数据为离散型，大多数变量不服从正态分布，故采用Spearman多元统计分析，可以反映不同元素含量是否具有显著(P < 0.05)或极显著(P < 0.01)相关关系，即某种元素含量随另一种元素含量变化的规律。相关矩阵分析显示，国产血竭(表 7)中有12对元素呈现显著正相关(P < 0.05)。另有6对元素呈极显著正相关(P < 0.01)，其中，Cu-Fe、Cu-Zn、Fe-Zn相关系数高达0.9以上水平，提示这些元素之间存在较好的协同吸收作用，表明某种元素含量升高或降低时其他元素的含量也会相应升高或降低的趋势。进口血竭(表 8)中，大部分元素均成一定程度正相关趋势，而Cu与Ca、Pb呈现显著负相关(P < 0.05)，Cr与Fe、Mg、Zn则呈现极显著负相关(P < 0.01)，反映出这些元素之间具有一定程度的相互拮抗抑制作用，即某种元素含量升高或降低时其他元素的含量反而会降低或升高的趋势。相关关系可能是药材在机体内发挥作用的机制，国产血竭、进口血竭具有明显差异的相关关系，推测可能是造成两者功效相似而不相同的原因。
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表 7 国产血竭中10种微量元素Spearman相关性分析 Tab.7 Spearman correlation analysis of 10 trace elements in Draconis Resina |
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表 8 进口血竭中10种元素Spearman相关性分析 Tab.8 Spearman correlation analysis of 10 trace elements in Draconis Sanguis |
微波消解-原子吸收法为2015年版《中华人民共和国药典》所收载的元素测定方法，相对于检测下限更低、成本昂贵的ICP-MS法，具有灵敏度高、测试成本低、推广性更强的优势，适合于实际应用。本研究采用火焰原子吸收法测定2种血竭中Fe、Cu、Zn、Mg、Ca、Sr、K元素含量，“火焰法”具有较高的稳定性和较好的重复性；对于含量较低的Pb、Cd、Cr重金属元素，为了更高的原子化效率以及防止化学背景干扰，采用灵敏度更高的“石墨炉法”进行测定。通过方法学考察，认为实验建立的元素测定方法准确、稳定、可靠。元素测定结果发现数据为离散型，Radar图分析法可以分层次解析多变量、多维度的数据，Spearman等级相关系数法适用于不符合正态分布的离散性数据分析，研究所采用的统计分析方法是科学合理的。
国产血竭、进口血竭作为临床上广泛应用的活血化瘀类中药，可外用也可内服，均有较好的作用，而两者基原植物不同，所含化学成分差异较大，国产血竭仍不能够完全代替价格昂贵的进口血竭，临床不应将两者混用。本研究从微量元素分析的角度，探讨了2种血竭中药效相关元素、重金属元素的分布规律和相关性。国产血竭、进口血竭中元素分布的不同和明显差异的相关关系可能是造成两者功效相似而不相同的原因，本文为2种血竭的临床使用和药效研究提供了重要依据。
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