2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 江西省南昌市洪都中医院, 南昌 330008
2. Nanchang Hongdu hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330008, China
尘螨(house dust mite，HDM)是一种全球性的环境变应原，主要寄居于人类住所。HDM可以引起过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性哮喘、特异反应性皮炎等疾病。当前全球范围内对螨虫过敏的人口数量约为1%~2%，在亚洲、大洋洲、欧洲、北美和南美洲的人口稠密地区，高达80%的哮喘病人对HDM过敏[1-3]。变应原免疫治疗是缓解过敏症最有效的治疗方法。利用螨变应原提取物进行脱敏治疗已有100多年的历史，可有效阻断过敏进程，对过敏性鼻炎和哮喘均具有很好的疗效[4-5]。而大量的研究表明质量稳定的螨变应原制品是脱敏治疗取得成功的关键[6-7]。变应原制品的效力测定是其质量控制的关键项目，且其效力高低对临床疗效具有指示作用。对产品质量控制来说，变应原制品体外效力的评价可通过测定制品对病人血清IgE抗体的抑制率(即变应原活性)进行，或者测定制品中主要变应原含量[7]。但含有铝佐剂制品的变应原含量测定会受到佐剂的干扰，难以获得准确的结果。
螨变应原注射液(商品名称Novo-Helisen-Depot，NHD)是一种氢氧化铝佐剂吸附的，屋尘螨和粉尘螨提取物等比例混合制备而成的皮下免疫治疗制剂，该制品组成复杂，生产企业尚未建立可用于成品体外效力测定的方法及相应的效力评价用参考品，因此亟需探索适用于NHD的体外效力测定方法。
Phardia公司的ImmunoCAP仪器及相应配套试剂，可通过商品化的IgE标准品(其IgE浓度可溯源至国际标准品)定量测定反应体系中的IgE浓度(kU·L-1)，被广泛用于过敏性疾病的体外诊断[8]。本研究探索用ImmunoCAP法测定NHD对尘螨过敏病人血清中IgE的抑制率的可行性，以期建立一种适用于NHD的体外效力测定方法，从而推动该制品质量标准的提高。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器ImmunoCAP100E全自动变应原分析仪器(瑞典Phadia公司)；Immuno CAPTM Specific IgE校准品、质控曲线、Anti-IgE (定量校正用CAP)、酶标二抗、屋尘螨(D. pteronyssinus，d1)、粉尘螨(D. farinae，d2)、发展液、洗液、终止液均购自Thermo公司；螨变应原注射液为Allergopharma公司产品；尘螨阳性血清由ALK-Abellop A/S(ALK)和Allergopharma(AP)公司提供，分别称为ALK阳性血清和AP阳性血清。
1.2 试验方法 1.2.1 ImmunoCAP法测定总变应原活性将80 µL待检样品与阳性血清等体积混合，将样品置于2~8 ℃冰箱孵育过夜(16~24 h)，然后5 000 g离心5 min，吸取上清液，转移至2 mL尖底离心管中。按照说明书对ImmunoCAP 100E进行日常维护，并按照系统提示将样品装载到仪器反应盘中，装载样品结束后，按下运行键，仪器将自动测定反应体系中屋尘螨(d1)特异性和粉尘螨(d2)特异性IgE浓度。将0.1 mol·L-1 PBS与阳性血清等体积混合作为阳性对照(0%抑制)。以制品对血清的抑制率作为变应原制品体外效力测定指标。抑制率的计算公式：
抑制率=100%×(阳性对照血清IgE测定值-样品孵育后血清IgE测定值)/阳性对照血清IgE测定值。
1.2.2 ImmunoCAP法测定上清中游离变应原活性取铝佐剂吸附的尘螨变应原制品，翻转轻摇混匀样品，取500μL样品置于1.5 mL离心管中，5 000 g离心10 min，吸取80µL上清液与阳性血清等体积混合进行孵育。其余操作参见“1.2.1”项下方法。
1.2.3 ImmunoCAP法的特异性验证利用“1.2.1”项中方法，分别测定大籽蒿花粉变应原与NHD对尘螨过敏病人血清IgE的抑制能力，观察该方法的特异性。
1.2.4 反应时间的影响测定方法参见“1.2.1”和“1.2.2”项下方法，设置37 ℃孵育2 h和2~8 ℃冰箱孵育过夜(16~24 h)2个反应条件，观察制品对血清中特异性IgE的抑制率。
1.2.5 血清稀释度的影响阳性血清池用0.1 mol·L-1的PBS缓冲液进行梯度稀释，按照“1.2.1”项下方法测定维持剂量NHD(规格为5 000 TU)对阳性血清池中屋尘螨特异性(d1)和粉尘螨特异性(d2)IgE的抑制率。
1.2.6 制品与阳性血清的量效反应关系选择1:5倍和1:10倍2个稀释度血清，将维持剂量NHD进行2倍系列梯度稀释，按照“1.2.1”项下的方法测定屋尘螨(d1)、粉尘螨(d2)特异性IgE值，并计算各自的抑制率；选择1:5倍稀释血清，利用“1.2.1”项下方法测定5批不同规格NHD(50、500、5 000 TU)的总变应原效力。
1.2.7 方法的精密度取维持剂量NHD共6份，采用“1.2.1”项下方法测定。
1.2.9 统计学分析采用GraphPad Prism 5.2软件对测定结果进行one-way ANOVA分析。
2 结果 2.1 特异性验证试验结果利用大籽蒿花粉变应原与NHD分别与AP阳性血清(1:5倍稀释)进行反应，同时用PBS与AP阳性血清进行孵育，作为阳性对照，即0%抑制，测定结果见表 1。花粉变应原孵育后的血清中屋尘螨特异性IgE(d1-IgE)浓度为21.5 kU·L-1，粉尘螨特异性IgE(d2-IgE)浓度为19 kU·L-1，与0%抑制中的d1-IgE浓度(22.7 kU·L-1)、d2-IgE浓度(19.9 kU·L-1)相比没有显著差异(q=2.081、2.246，P > 0.05)。NHD孵育后的血清中d1-IgE浓度(7.9 kU·L-1)、d2-IgE浓度(5.49 kU·L-1)明显降低，与0%抑制中的d1-IgE和d2-IgE浓度相比差异显著(q=25.94、36.089，P < 0.05)；与花粉变应原孵育后血清中d1-IgE和d2-IgE浓度相比差异显著(q=23.86、33.84，P < 0.05)。花粉变应原对血清中d1-IgE、d2-IgE抑制率为5.29%和4.52%，而NHD对d1-IgE和d2-IgE抑制率分别为66.11%和73.5%，明显高于花粉变应原对血清中IgE的抑制率(q=27.01、23.64，P < 0.05)，表明NHD能够抑制螨变应原特异性阳性血清中的IgE，而花粉变应原不能抑制螨变应原特异性阳性血清中的IgE，因此利用ImmunoCAP法测定NHD的生物活性，具有较好的特异性。
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表 1 ImmunoCAP法测定NHD效力的特异性分析 Tab.1 Specificity analysis of ImmunoCAP for NHD potency assay |
维持剂量NHD与尘螨病人血清孵育，反应条件分别为37 ℃孵育2 h和2~8 ℃冰箱孵育过夜(16~24 h)。37 ℃孵育2 h的d1-IgE抑制率(65.6%)、d2-IgE抑制率(67.5%)与2~8 ℃冰箱孵育过夜的d1-IgE抑制率(65.8%)、d2-IgE抑制率(70.5%)差异不显著(t=0.088、3.368，P > 0.05)。37 ℃孵育2 h的游离上清的d1-IgE抑制率(5.77%)、d2-IgE抑制率(12%)与2-8 ℃冰箱孵育过夜的d1-IgE抑制率(5.92%)、d2-IgE抑制率(8.9%)差异不显著(t=0.74、3.385，P > 0.05)。
2.3 血清及其稀释度的影响AP阳性血清用0.1 mol·L-1的PBS缓冲液进行梯度稀释，测定维持剂量NHD对阳性血清池中IgE的抑制率，测定结果见表 2。随着血清的不断稀释，血清中特异性IgE值不断下降，但抑制率的下降较平缓。只要血清IgE值不低于临界值0.35 kU·L-1时，维持剂量NHD对血清中IgE的抑制率就不低于50%。
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表 2 制品与不同稀释度血清中IgE的反应结果 Tab.2 Results of products with IgE of serum with different dilution |
测定维持剂量NHD对2个不同来源阳性血清(AP和ALK阳性血清)中IgE的抑制率，NHD对2种AP和ALK阳性血清的d1-IgE抑制率分别为(75.8±0.51)%、(71.7±0.71)%，两者之间没有明显差异(t=3.69，P > 0.05)；对d2-IgE抑制率分别为(80.7±0.21)%、(78.6±1.63)%，两者之间也没有明显差异(t=1.77，P > 0.05)。表明不同来源的阳性血清对制品的d1-IgE、d2-IgE抑制率测定值的影响不显著。
2.4 制品与阳性血清的量效反应关系将维持剂量NHD进行2倍梯度稀释，分别与1:5倍和1:10倍稀释的AP阳性血清进行孵育，测定制品对血清中特异性IgE的抑制率，结果见图 1。图 1-A和图 1-B结果表明，随着维持剂量NHD中总变应原浓度的降低，抗原-血清反应体系中的d1-IgE、d2-IgE值不断增高，接近阳性对照(2个稀释度阳性对照中的d1-IgE值分别为26.2 kU·L-1和12.7 kU·L-1，d2-IgE抑制率分别为19.4 kU·L-1和10.3 kU·L-1)。图 1-C和图 1-D结果表明，制品对AP阳性血清中d1-IgE和d2-IgE的抑制率随着维持剂量NHD中总变应原浓度的降低逐渐减小，制品与2种稀释度血清量效反应趋势基本一致。
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A.系列稀释的NHD制品与1:5倍和1:10倍稀释阳性血清孵育后d1-IgE值(d1-IgE value assay result of positive serum after incubation with serial-diluted-NHD) B.系列稀释的NHD制品与1:5倍和1:10倍稀释阳性血清孵育后d2-IgE值(d2-IgE value assay result value assay result of positive serum after incubation with serial-diluted-NHD) C.系列稀释的NHD制品与1:5倍和1:10倍稀释阳性血清孵育后d1-IgE的抑制率(d1-IgE inhibition ratio after serial-diluted-NHD incubation different dilution positive serum) D.系列稀释的NHD制品与1:5倍和1:10倍稀释阳性血清孵育后d2-IgE的抑制率(d2-IgE inhibition ratio after serial-diluted-NHD incubation different dilution positive serum) 图 1 维持剂量NHD经系列稀释后与阳性血清的量效反应关系 Fig.1 Dose-response relationship between maintenance dose of NHD with different dilution and positive serum |
对ImmunoCAP法测定维持剂量NHD中d1-IgE、d2-IgE抑制率进行精密性验证，重复测定6次，连续测定3 d。结果d1-IgE抑制率的平均值为69.45%，日内RSD为1.7%，日间RSD为4.4%；d2-IgE抑制率的平均值为77.2%，日内RSD为1.3%，日间RSD为4.4%。结果表明ImmunoCAP法具有较好的精密性。
2.6 不同规格制品对血清中IgE的抑制率比较分析选定5批起始治疗用NHD试剂盒(内含3个规格制品)，分别测定规格为50 TU(起始剂量)、500 TU(递增剂量)、5 000 TU(维持剂量)制品的d1-IgE、d2-IgE抑制率，测定结果见图 2。其中5 000 TU-d1-IgE抑制率(71.9%、70.15%、71.6%、70.5%、66.05%)与500 TU-d1-IgE抑制率(50.42%、46.44%、37.95%、20.95%、27.02%)相比较，差异显著(28.96≤t≤39.75，P < 0.001)；500 TU-d1-IgE抑制率与50 TU-d1-IgE(2.93%、6.28%、6.05%、15.8%、8.1%)相比较，差异显著(7.636≤t≤27.37，P < 0.001)。5 000 TU-d2-IgE抑制率(79.04%、78.75%、74.75%、73.50%、73.50%)与500 TU-d2-IgE抑制率(63.64%、59.18%、45.85%、33.10%、30.70%)相比较，差异显著(14.08≤t≤39.5，P < 0.001)；500 TU-d1-IgE抑制率与50 TU-d1-IgE相比较，差异显著(18.11≤t≤46.54，P < 0.001)。规格为5 000 TU制品的d1-IgE、d2-IgE抑制率的批间RSD分别为3.3%和3.5%；规格为500 TU制品的d1-IgE、d2-IgE抑制率的批间RSD分别为26%和30%；规格为50 TU制品的d1-IgE、d2-IgE抑制率批间RSD分别为62%和32%。
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A. 5批制品d1-IgE抑制(d1-IgE inhibition ratios of 5 batches for NHD) B. 5批制品d2-IgE抑制率(d2-IgE inhibition ratio of 5 batches for NHD) 图 2 不同规格NHD总变应原特异性IgE的测定结果 Fig.2 Results of total allergen IgE of different specification of NHD |
连续测定了13批维持剂量NHD对阳性血清中d1-IgE、d2-IgE的抑制率，结果见图 3。结果表明总变应原的d1-IgE抑制率在68.2%~76.9%之范围内，d2-IgE的抑制率在74.7%~79.6%范围内。上清液游离变应原的d1-IgE抑制率在6.74%~19.2%范围内，d2-IgE抑制率在1.8%-15.4%范围内。13批制品总变应原的d1-IgE、d2-IgE抑制率均值分别为72.7%、78.1%，RSD为3.8%、2.3%，总变应原的d1-IgE、d2-IgE抑制率全部高于50%；上清游离变应原的d1-IgE、d2-IgE抑制率平均值分别为12.7%、8.3%，RSD为14%、25%。证明ImmuonCAP用于测定维持剂量NHD，结果稳定，且一致性好，13批维持剂量制品总变应原对血清中IgE抑制率均大于50%；上清中游离变应原对血清中IgE抑制率均不高于20%。
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图 3 13批维持剂量NHD总变应原及上清游离变应原的d1-IgE(A)、d2-IgE抑制率(B)测定结果 Fig.3 d1-IgE(A) and d2-IgE(B) inhibition rates of total allergen activity and free allergen activity of supernatant for 13 batches of NHD |
效力评价是确保生物制品质量的重要指标。螨变应原制品的效力评价结果既能有效指示制品的批间一致性，也能显示制品在贮存和运输过程中的稳定性，因此在其成品放行质控中进行效力评价的意义不言自明。变应原制品体外效力评价方法有特异性IgE抑制率测定法和主要变应原含量测定法，但对于含有铝佐剂的制品，通过测定制品对阳性血清中IgE的抑制率作为效力评价方法更具有实用性，可避免铝佐剂解吸附对测定结果准确性的干扰。
欧美等国均以IgE抑制率作为评价变应原制品体外效力的重要指标，主要测定方法有竞争性ELISA法和ImmunoCAP法[2, 7, 9-10]。竞争性ELISA法需要有相应的抗原参考品，通过参考品来评价制品对血清中IgE的抑制能力，而目前尚未针对NHD制品建立效力测定用的参考品，因此竞争性ELISA抑制法目前还不适用于NHD的效力评价。ImmunoCAP法的优势是可不依赖于企业的参考品，可通过商品化配套试剂定量测定反应体系中的IgE浓度，因而对于尚未建立抗原参考品的变应原类制品进行IgE抑制率评价，具有一定的优势[8]。在ImmunoCAP检测系统中，商品化的屋尘螨抗原和粉尘螨抗原吸附与高亲和力的纤维素材料上(CAP)，仪器可将待检测样本加入到CAP上，特异性IgE与CAP上的特定抗原结合，再进一步与酶底物结合，最后通过酶底物上的荧光强度，可计算出反应体系中的IgE浓度。ImmunoCAP法已被用于测定铝佐剂吸附的屋尘螨变应原制剂的IgE抑制能力，主要通过测定制品与阳性血清孵育前后反应体系中的IgE浓度，计算制品对血清中IgE的抑制率[11-12]。
本研究利用ImmunoCAP法检测了NHD对尘螨过敏病人血清中IgE的抑制率，结果表明NHD作为一种氢氧化铝吸附的螨变应原制品，保持了IgE的结合能力，对阳性血清中的d1-IgE、d2-IgE抑制率均高于50%。采用ImmunoCAP法测定NHD的IgE抑制力，操作简便，结果特异性好，不同反应条件下，制品和游离上清对尘螨过敏病人血清中的IgE抑制率结果基本一致。NHD制品对血清中d1-IgE、d2-IgE的抑制率与变应原浓度直接相关，抑制率随制品中变应原浓度的降低而减小，因此制品的IgE抑制率对变应原浓度有一定的提示作用，而变应原浓度是决定该类制品脱敏效果的最直接质量参数，因而研究结果提示IgE抑制率可作为NHD制品的体外效力评价指标。
由于初始治疗NHD试剂盒存在高、中、低3个浓度规格，进一步测定了不同规格NHD制品的体外效力。不同规格制品间的d1-IgE、d2-IgE抑制率差异显著，随着制品效力规格的下降，制品对血清中IgE抑制率降低，进一步证实了变应原浓度与制品IgE抑制率具有一定的相关性。对5批不同规格NHD效力测定结果批间RSD进行了分析，其中维持剂量(规格为5 000 TU)制品的d1-IgE、d2-IgE抑制率批间RSD不超过5%，具有较好的批间一致性；500 TU和50 TU制品的d1-IgE、d2-IgE抑制率批间RSD均超过20%。可能是该计算方法自身局限所致；也是低浓度变应原稳定性差，存储过程中出现降解。目前的研究结果表明ImmunoCAP法仅适用于维持剂量(规格为5 000 TU)制品的效力评价。
对于铝佐剂吸附的AIT制品，还需要测定成品上清中游离的可溶性蛋白浓度或游离蛋白的活性，以评价吸附效率和监测吸附后的稳定性[11]。本研究采用ImmunoCAP法测定13批维持剂量NHD上清溶液中游离变应原的IgE抑制率(游离变应原活性)，结果表明游离变应原的d1-IgE、d2-IgE抑制率均不超过20%，但测定结果的批间变异较大，RSD高达25%，与之前文献报道[11-12]一致。本研究中也对游离变应原活性测定结果进行了精密性分析，3 d共18个样本的d1-IgE、d2-IgE的抑制率均不超过20%，但是RSD较大，可高达41%。上清游离变应原抑制率变异度大的最主要的原因可能是上清游离蛋白的IgE抑制率比较低，所测结果已接近阳性对照值，因此所计算抑制率已近似于该方法的最低测定限值。而所有上清游离变应原的抑制率不超过20%，此结果对于吸附的稳定性有一定的提示作用，因而可以作为ImmuonCAP法测定NHD上清游离变应原活性的判定标准。
在今后的研究中，需要进一步探索ImmunoCAP法测定变应原特异性IgE抑制率的最佳测定范围及检测限度，同时需要扩大样本量深度分析该法测定中、低浓度变应原制品存在RSD较大的原因，以合理拓宽该方法用于变应原制品体外效力评价的适用范围，并进一步完善相应的质量标准，确保效力评价能真实指示制品的有效性。
综上所述，本研究表明ImmuonCAP法可作为维持剂量NHD总变应原及上清游离变应原的体外效力评价方法。利用该法测定维持剂量NHD对阳性血清中特异性IgE的抑制率，总变应原特异性抑制率均高于50%，结果稳定，重复性好；该法用于NHD制品上清游离变应原的效力评价时，游离变应原的抑制率应不超过20%。
| [1] |
THOMAS WR, HALES BJ, SMITH WA. House dust mite allergens in asthma and allergy[J]. Trends Mol Med, 2010, 16(7): 321. DOI:10.1016/j.molmed.2010.04.008 |
| [2] |
LEE KS, YUM HY, SHEEN YH, et al. Comorbidities and phenotypes of rhinitis in Korean children and adolescents:a crosssectional, multicenter study[J]. Allergy Asthma Immunol Res, 2017, 9(1): 70. DOI:10.4168/aair.2017.9.1.70 |
| [3] |
CALDERON MA, LINNEBERG A, KLEINE-TEBBE J, et al. Respiratory allergy caused by house dust mites:what do we really know[J]. J Allergy Clin Immunol, 2015, 136(1): 38. DOI:10.1016/j.jaci.2014.10.012 |
| [4] |
LEE JH, KIM SC, CHOI H, et al. A retrospective study of clinical response predictors in subcutaneous allergen immunotherapy With house dust Mites for Allergic Rhinitis[J]. Allergy Asthma Immunol Res, 2018, 10(1): 18. DOI:10.4168/aair.2018.10.1.18 |
| [5] |
BOZEK A, KOLODZIEJCZY K, KLZLWOSKA R, et al. Evidence of the efficacy and safety of house dust mite subcutaneous immunotherapy in elderly allergic rhinitis patients:a randomized, double-blind placebo-controlled trial[J]. Clin Transl Allergy, 2017, 7(1): 811. |
| [6] |
CARNES J, IRAOLA V, CHO SH, et al. Mite allergen extracts and clinical practice[J]. Ann Allergy Asthma Immunol, 2017, 118(3): 249. DOI:10.1016/j.anai.2016.08.018 |
| [7] |
ZIMMER J, VIETHS S, KAUL S. Standardization and regulation of allergen products in the European Union[J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2016, 16(3): 21. DOI:10.1007/s11882-016-0599-4 |
| [8] |
van HAGE M, HAMSTEN C, VALENTA R. ImmunoCAP assays:Pros and cons in allergology[J]. J Allergy Clin Immunol, 2017, 140(4): 974. DOI:10.1016/j.jaci.2017.05.008 |
| [9] |
CARNES J, IRAOLA V, GALLEGO M, et al. Control process for manufacturing and standardization of allergenic molecules[J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2015, 15(7): 37. DOI:10.1007/s11882-015-0541-1 |
| [10] |
SPIRIC J, REUTER A, RABIN RL. Mass spectrometry to complement standardization of house dust mite and other complex allergenic extracts[J]. Clin Exp Allergy, 2017, 47(5): 604. DOI:10.1111/cea.12931 |
| [11] |
王春娥, 石继春, 王珊珊, 等. 屋尘螨变应原制品活性测定方法的建立[J]. 药物分析杂志), 2013, 33(5): 775. WANG CE, SHI JC, WANG SS, et al. Bioactivity detection method for Dermatophagoides pteronyssinus products[J]. Chin J Pharm Anal, 2013, 33(5): 775. |
| [12] |
石继春, 王春娥, 王珊珊, 等. 屋尘螨变应原制剂质量标准的研究[J]. 中国药事, 2014, 28(6): 622. SHI JC, WANG CE, WANG SS, et al. Study of quality standards of mites allergens ALK D. P[J]. Chin Pharm Aff, 2014, 28(6): 622. |