小蓟(Cirsium setosum)俗称“刺儿菜”，主治吐血、衄血、创伤出血、疔疮、痈毒。《本草新编》中记载其入肺、脾二经。关于小蓟的用药部位，不同的典籍中有不同的记载。仅止血一项，就有以全草、叶、根等入药的记载。关于小蓟入药的现代研究，集中在化学研究、成分分离^[1-2]、成分鉴定^[3]或炮制前后，蒙花苷、柳穿鱼叶苷等少数几个指标性成分含量变化上^[4]，其化学成分与药效间关系并未得到合理解释，相关文献鲜有报道。根据文献调研及前期药效学实验研究发现，小蓟提取物对癌细胞具有一定的抑制作用^[5]，本实验应用微流控芯片技术，以小蓟不同部位提取物的抗肺癌活性为基础，又建立小蓟不同用药部位的指纹图谱，通过灰色关联度的分析方法对小蓟不同部位的成分与药效进行“谱效关系”分析，并采用对照品比对，根据色谱保留时间对其与药效关联度大的化学成分进行分析与鉴定。建立了化合物与药效的联系^[6]，又提出了一个精准分析方法并为小蓟的合理用药及确定小蓟的质量标志物提供科学依据。

1 仪器与试药 1.1 仪器

LSP04-1A精密注射泵(保定兰格公司)；NUAIRETM US AUTOFLOW型CO₂培养箱(NUAIRE公司)；SU-8 2075负性光刻胶；Sylgard184型聚二甲基硅氧烷(PDMS)；固化剂(Dow Corning公司)；JKG-2A型光刻机(上海学泽光学机械有限公司)；HPDC-32G-2型等离子清洗机(Harrick Plasma公司)；SC-1B型匀胶机(北京创世威纳科技有限公司)；Nikon ECLIPSE TI倒置荧光显微镜(Nikon公司)；Agilent 1290型快速高效液相色谱仪(安捷伦公司)。

1.2 试剂与药材

乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；冰乙酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；细胞凋亡与坏死检测试剂盒(Hoechst 33342和PI，北京索莱宝，批号20171019)。

小蓟药材，购自山东，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室许亮副教授鉴定为菊科植物小蓟Cirsium setosum(Willd.)MB.的干燥全株。

2 方法与结果 2.1 芯片的设计与制作

实验设计的PDMS-玻璃微流控芯片从上到下依次为流体通道层和玻璃基片层。主要通道为流体通道，包括流体通道区和细胞培养区，其厚度约3 mm，长5 cm，宽4 cm。其中包括16个入口、1个废液出口；细胞培养区由细胞培养腔组成，每个培养腔尺寸为1.0 mm×1.2 mm的椭圆形，实物图如图 1所示。

2.2 供试品溶液的制备

将小蓟药材按根、茎、叶、花分开，粉碎，过3号筛，各取粉末约5.0 g，置于圆底烧瓶中，精密加入95%乙醇溶液200 mL，加热回流提取1 h，放冷，滤过，取续滤液摇匀过0. 22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.3 体外药效学评价

人肺癌细胞A549，常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，取对数生长期的细胞接种于芯片中，待细胞贴壁后，以0.2 μL·min^-1的流速经蠕动泵灌注给药(取供试品溶液5 mL挥干，用培养液稀释至10 mL，经计算，培养液中的药物质量浓度为0.012 5 g·mL^-1)刺激24 h，参照文献中方法^[7-8]用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)染液对细胞进行双染，使用Hoechst33342和PI双染试剂盒，按照说明书操作，对芯片中的细胞进行染色。使用荧光倒置显微镜对芯片中的复孔进行拍照。使用IPP(Image-Pro Plus)软件在图片中选取荧光颜色的范围，根据输出的计数结果，进行凋亡坏死率的计算。其结果数据见表 1，双染结果见图 2。

2.4 小蓟不同药用部位指纹图谱的建立 2.4.1 色谱条件

色谱柱Agilent poroshell SB-C₁₈(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)，流动相乙腈(B)-0.5%乙酸(A)，梯度洗脱(0~6 min，5.0%→13% B；6~20 min，13% B；20~60 min，13%→22% B；60~90 min；22.0% →100.0% B)，柱温30 ℃，检测波长260 nm，进样量10 μL。

2.4.2 HPLC指纹图谱

取“2.2”项供试品溶液按“2.4.1”项色谱条件，进行分析检测，得到小蓟药材不同入药部位的液相图谱，见图 3。将图谱信息导入中药指纹图谱相似度评价软件(2012版)，得到小蓟不同用药部位的指纹图谱，见图 4。从指纹图谱中峰面积及数量可以看出4个入药部位的化学成分具有一定的差异性。

2.5 对照品比对与灰色关联度分析

经前期文献调研^[9-11]，确定了多种小蓟药材中可能存在的成分。经过比对保留时间，最终确定了11个存在于小蓟药材中的成分。

将细胞的凋亡坏死率作为母序列，图谱中11个成分的峰面积作为子序列，采用灰色关联度分析软件(GreyModeling_V3. 0)进行分析。得出小蓟不同药用部位色谱峰与其凋亡坏死率的关联系数。结果见表 2。

根据与凋亡坏死率的相关性大小，可以看出橙皮苷、咖啡酸、蒙花苷与体外药效关联度较大。

3 结论与讨论

中药发挥药效和药材的使用部位密切相关，《中华人民共和国药典》对用药部位有严格的规定，随着现代科学技术的发展，对中药研究的不断深入，药材不同部位的存在成分的差异和药效的差异，药材不同用药部位的精准应用，是中药更好发挥药效基本保证，本文以中药小蓟为研究对象，针对小蓟诱导肺癌细胞凋亡坏死的程度，研究不同部位的精准使用。

微流控芯片作为一种高通量筛选方法，采用精密注射泵集中控制，以低流速，在毫米级的芯片孔径内进行动态灌注，更好地模拟了体内环境，更加贴近细胞生理条件。作用24 h，用药不足0.5 mL，极大地减少了药液的消耗。随着显微荧光技术、影像处理技术的发展，微流控芯片在药学领域的应用会不断增加^[12-13]。

本实验将微流控芯片技术与中药指纹图谱技术相结合，建立了小蓟药材不同用药部位的指纹图谱。因灰色关联度分析法是一种多因素统计分析方法，它是以各因素的样本数据为依据用灰色关联度来描述因素间关系的强弱、大小和次序，故选择灰色关联软件将药效与有效成分进行关联^[14]。结果显示，体外药效结果花 > 叶 > 茎≈根，其中小蓟花诱导肺癌细胞凋亡坏死率可达到88.13%，与前期在96孔板中进行的预实验的结果趋势一致。灰色关联度软件计算得出，橙皮苷、咖啡酸、蒙花苷与体外药效的关联系数较大，可能为主要的药效成分。

现代中药的研究，离不开传统理论、传统典籍的指导，也离不开现代分析手段的应用。从原来药效物质基础的“整体模糊”，逐渐实现“局部清晰”^[15]。本实验通过灰色关联分析，将小蓟不同入药部位的抗肺癌体外药效与指纹图谱中的色谱峰相关联，明确相关程度，为用药部位精准、质量标志物(Q-Marker)^[16-17]的研究奠定基础。