2019, Vol. 39 
2. 浙江大学化学系, 杭州 310028
2. Chemistry Department, Zhejiang University, Hangzhou 310028, China
乳酸左氧氟沙星化学名称为(S)-(-)-9-氟-2，3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶并(l，2，3-de)-[l，4]苯并噁嗪-6-羧酸乳酸盐，其有效成分为左氧氟沙星，是氧氟沙星的左旋光学异构体。左氧氟沙星最早由日本第一制药株式会社研发，1997年，浙江医药新昌制药厂在国内率先成功开发乳酸左氧氟沙星原料药并获新药证书，使得左氧氟沙星开始实现国产化。乳酸左氧氟沙星的抗菌活性为氧氟沙星的2倍，毒性低[1]；与左氧氟沙星相比，乳酸左氧氟沙星具有更好的水溶性，更好的抗菌效果，更高的生物利用度，故此在国内临床上得到广泛应用[2-4]。
目前，乳酸左氧氟沙星的药品质量标准未被载入2015年版《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)，现行的原料药的权威药品质量标准为2000年版《中国药典》2004年增补本，但其中未提及该药品的多晶型现象。多晶型药物的理化性质和生物利用度可能存在较大差别，并对药物制剂生产过程及药物的溶出特性、稳定性产生影响，已引起了广泛的关注和重视[5-6]。由于结晶过程控制条件的不同，可能使生产得到的乳酸左氧氟沙星的晶型不同；另外，不同企业使用的多是企业内控标准，其中的含水量和晶型问题非常混乱、相互矛盾，因此，研究并确定稳定、准确、可靠的乳酸左氧氟沙星的晶型质量标准非常必要。
国内外专利和文献报道了左氧氟沙星多晶型现象，其存在晶型A、B、C、F、G、H、α、β、γ、一水合物晶型以及半水合物晶型11种晶型[7-9]，其中半水合物晶型最稳定，为药用晶型[10]。针对左氧氟沙星半水合物晶型，Gorman等[11]结合X-射线衍射分析(XRD)、拉曼光谱、热分析(TGA-DSC)等技术手段，详细阐述了左氧氟沙星半水合物晶型的固体形态、晶型稳定性及其脱水过程。
迄今为止，尚未有相关专利、文献对国内的乳酸左氧氟沙星晶型进行研究报道。本文拟采用粉末X-射线衍射(PXRD)、单晶X-射线衍射(SXRD)和TGA-DSC技术，对乳酸左氧氟沙星的晶型进行研究，以期为乳酸左氧氟沙星的晶型研究提供基础数据，也对企业生产中的晶型质量控制具有指导意义。
1 仪器与材料 1.1 材料与试剂乳酸左氧氟沙星原料药由浙江京新药业股份有限公司提供，样品经HPLC测定，纯度 > 99.6%，经PXRD测定为结晶型。乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜等有机溶剂均为分析纯试剂(天津永大化学试剂有限公司)，蒸馏水。
1.2 仪器与实验条件X-射线单晶衍射表征：取大小为0.27 mm×0.15 mm×0.05 mm的乳酸左氧氟沙星单晶，置于英国牛津(瓦里安)公司Gemini A Ultra单晶X射线衍射仪上，在173(2) K温度下用Cu Kα射线(λ=1.541 84Å)进行初步检验和数据收集。用SHELXS97(Sheldrick，2014)和SHELXL97(Sheldrick，2014)进行结构解析和修正。使用Diamond获得结构图。
X-射线粉末衍射表征：将样品置于日本理学公司Rigaku D/Max-2550 PC粉末X射线衍射仪上，测试条件为CuKα射线(λ= 1.540 6 Å)，电压40 kV，电流250 mA，扫描范围3°~40°(2θ)，步宽0.02°，扫描速度5°·min-1。所得数据用MDI-Jade version 7.5.1软件处理。
TGA和DSC测定：将样品置于美国TA公司DSC Q100差示扫描量热仪上，测定条件：以氮气为保护气，升温速率为10 ℃·min−1，升温范围为室温~260℃，进行DSC分析，另将样品从室温降温至-50 ℃，降温速率为10 ℃·min−1，等温3 min后升温至90 ℃，升温速率为10 ℃·min−1，等温30 min后降温至-50 ℃，降温速率为10 ℃·min−1，等温3 min后再次升温至250 ℃，升温速率为10 ℃·min−1，进行DSC热循环分析；将样品置于美国TA公司SDT Q600综合热分析仪上，以氮气为保护气，升温速率为10 ℃·min−1，升温范围为25~420 ℃，进行热重分析。
2 方法与结果 2.1 晶型筛选与制备本文采用冷却析晶法、反溶剂沉淀法及高温转晶法等方式，设置不同的溶剂、温度、速度及时间等参数，对乳酸左氧氟沙星进行系统的多晶型筛选，共发现2种结晶型乳酸左氧氟沙星，命名为晶型Ⅰ(一水合物晶型)、晶型Ⅱ(半水合物晶型)。
2.1.1 乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ的制备称取乳酸左氧氟沙星5 g，加入95%乙醇水50 mL，加热至完全溶解，自然冷却析晶，抽滤，于45 ℃下减压干燥，得晶型Ⅰ样品。
2.1.2 乳酸左氧氟沙星晶型Ⅱ的制备称取乳酸左氧氟沙星5 g，加入二甲基亚砜30 mL，加热至完全溶解，置冰水浴中快速冷却析晶，抽滤，于45 ℃下减压干燥，得晶型Ⅱ样品。
2.1.3 单晶制备在干净的称量瓶中加入乳酸左氧氟沙星0.1 g，加入适量的四氢呋喃-水(9:1)溶解，使溶液接近饱和状态，置于30 ℃下放置1~3 d，得无色透明针状晶体。
2.2 SXRD分析SXRD分析表明，乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ属于单斜晶系，C2空间群；晶胞参数a=17.499 0(5)Å，b=6.874 0(3)Å，c=18.309 0(5)Å，β=90.445(2)°，晶胞体积V=2 202.29(13)Å3；晶胞内分子数Z=4。其最小不对称单元中含有1个左氧氟沙星阳离子，1个乳酸阴离子和1个水分子，因此，乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ是一水合物晶型。
乳酸分子上的H+转移到左氧氟沙星分子中的哌嗪环上的胺基氮上(N3)，形成左氧氟沙星阳离子，与乳酸阴离子通过N3-H3A…O5(2.592(13)Å，178°)氢键连接，形成离子对；水分子通过O8-H81…O5(2.41(7)Å，147°)氢键与乳酸阴离子相连接；同时，左氧氟沙星分子上的羧基与相邻的羰基形成O2-H2…O4(2.514(5)Å，154°)分子内氢键(如图 1-A所示)。这样的分子结构在三维空间无限堆叠，形成沿c方向堆叠的层状结构(如图 1-B和1-C所示)，层间距为18.3Å，正好是晶胞C轴的长度，表现在PXRD图上，对应的(001)方向有强的衍射峰，其d001为18.3Å，对应的衍射角2θ为4.8°。乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ的1分子结晶水正处于由左氧氟沙星分子构成的“层间孔道”中，属于典型的层间水，这个层间水分子与晶格中其他基团的范德华力、氢键作用力等强度较弱，进而提示少量的层间水分子容易从晶格中丢失，而不改变整体晶格结构。层间水量的微小变化，如层间含水量3.5%~4.5%，其晶体结构并不发生改变，改变的只是层间距的大小(即d001)，符合典型的层状化合物的结构特征[12-13]。
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A.乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ的不对称单元(the asymmetric unit of levofloxacin lactate form Ⅰ) B.乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ在晶胞中的分子排列(为使图更清晰，省略了不参与氢键形成的氢原子)(molecular arrangement of levofloxacin lactate crystal form Ⅰ in unit cell and H atoms not involved in hydrogen bonding have been omittedfor clarity) C.乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ的分子堆叠图(为使图更清晰，省略了不参与氢键形成的氢原子)(packing diagram of levofloxacin lactate form Ⅰ viewed along the a-axis and H atoms not involved in hydrogen bonding have been omittedfor clarity) D.BFDH模型乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ预测晶习(crystal habit of levofloxacin lactate form Ⅰ predicted by BFDH model) E.乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ的显微镜照片(crystal image of levofloxacin lactate form Ⅰ) 图 1 乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ Fig.1 Levofloxacin lactate form Ⅰ |
将得到的乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ的晶体结构信息导入Materials Studio软件，通过Morphlolgy模块中BFDH模型，对其晶习进行预测。模拟结果如图 1-D所示，模拟晶体外形呈片状，001及其对应等价面为最主要晶面，对应于PXRD图中最强衍射峰(2θ为4.8°)。图 1-E显示了实验产品的光学显微镜照片，外形为长条针状，通过比较可以看出，模拟结果与实验得到的晶体的晶习相似，但仍有一些区别。由于模型计算只是从晶体本身的内部结构角度对晶习预测，没有考虑外界环境对晶体生长的影响，而实际结晶过程中得到的晶习同时受到热力学和动力学的综合作用，因此，在不同的结晶条件下得到晶体的实际晶习与模型计算得到的理论晶习可能有一定差别。
2.3 TGA-DSC采用TGA-DSC相结合的方法，全面分析乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ和晶型Ⅱ的热效应。晶型Ⅰ的DSC曲线(图 2-A)显示，在约室温~100 ℃范围内有1个很宽泛的吸热失水峰，推测为层间水分子缓慢脱水所致；对应的TGA在室温~110 ℃出现1个失重平台，失重量为4.0%，为失去1个结晶水所致(一水合物晶型的理论水含量3.84%)；在110~270 ℃出现第2个失重平台，为样品热降解所致。晶型Ⅱ的DSC曲线(图 2-B)显示，在约50~100 ℃范围内有1个吸热失水峰；对应的TGA在室温~110 ℃出现1个失重平台，失重量为2.6%，为失去0.5个结晶水所致(半水合物晶型的理论水含量1.96%)；在110~275 ℃出现第2个失重平台，为样品热降解所致。
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图 2 乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ(A)、晶型Ⅱ(B)的TGA-DSC图 Fig.2 DSC and TGA curves of levofloxacin lactate for form Ⅰ(A)and form Ⅱ(B) |
采用PXRD对乳酸左氧氟沙星的2种晶型进行表征。研究表明，乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ和晶型Ⅱ的主要特征衍射峰位置、强度及数量有明显不同，如图 3、表 1所示，表中2θ为衍射角，d为晶面间距，均表示衍射峰的位置，I/I0为相对强度，表示衍射峰的强度。因此，利用PXRD技术可以有效地对2种晶型进行鉴别。
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图 3 乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ模拟图(A)、晶型Ⅰ实测图(B)和晶型Ⅱ实测图(C)的PXRD图 Fig.3 Overlay of RXRD patterns of levofloxacin lactate of calculated pattern of form Ⅰ(A), experimental pattern of form Ⅰ(B)and experimental pattern of form Ⅱ(C) |
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表 1 乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ及晶型Ⅱ的PXRD数据 Tab.1 PXRD characteristic peaks of form Ⅰ and form Ⅱ |
乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ和晶型Ⅱ的高湿稳定性研究显示：晶型Ⅰ在25 ℃、相对湿度90% ± 5%条件下放置10 d，晶型保持不变；晶型Ⅱ放置仅1 d后迅速转变为晶型Ⅰ和晶型Ⅱ的混合物，表明晶型Ⅱ极易吸湿，不易保存。热稳定性研究表明：晶型Ⅰ在60 ℃条件下热处理1 h后，晶型保持不变，在70~10℃条件下热处理1 h后，转变为晶型Ⅰ和晶型Ⅱ的混合物，随着温度升高，晶型Ⅱ含量越高，在130 ℃条件下热处理7 h后，则全部转变成晶型Ⅱ；晶型Ⅱ在50~130 ℃条件下热处理1 h后，晶型保持不变，表明晶型Ⅱ的热稳定性优于晶型Ⅰ。
采用DSC热循环方法对2种晶型热相变过程进行研究，探寻无水晶型是否能稳定存在。将晶型Ⅰ和晶型Ⅱ放入铝小皿中，开口，升温至90 ℃，等温30 min后，冷却至-50 ℃，再次升温时，仍在82 ℃左右处出现失水吸热峰(图 4)；另将晶型Ⅰ和晶型Ⅱ放入铝小皿中，加盖，压制，重复实验，实验结果相同。由此认为，乳酸左氧氟沙星在常温常压条件下不存在无水晶型，推测其无水晶型在降温过程中迅速吸收环境中的微量水分转变成半水合物晶型(晶型Ⅱ)。这也与PXRD热处理结果一致，即晶型Ⅱ在130 ℃条件热处理5 h后，晶型仍保持不变。
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图 4 乳酸左氧氟沙星晶型Ⅰ(A)及晶型Ⅱ(B)的热循环DSC图(插图为-50~90 ℃的热循环放大图) Fig.4 DSC thermograph of levofloxacin lactate form Ⅰ(A)and form Ⅱ(B)analyzed in an aluminum pan without a lid(the insert expands the data from the temperature cycles between -50 ℃and 90 ℃) |
本文采用冷却析晶法、反溶剂沉淀法及高温转晶法等方式，制备获得了乳酸左氧氟沙星2种晶型：晶型Ⅰ(一水合物晶型)和晶型Ⅱ(半水合物晶型)；用PXRD和TGA-DSC可实现对乳酸左氧氟沙星不同晶型的鉴别，研究获得的乳酸左氧氟沙星晶型的标准谱图，可用于乳酸左氧氟沙星的晶型鉴别与质量控制，对企业生产过程中的晶型质量控制有指导意义。稳定性研究表明，晶型Ⅰ的高湿稳定性显著优于晶型Ⅱ，而高温稳定性较差，在高于70 ℃下会缓慢脱水向晶型Ⅱ转变；晶型Ⅱ在高湿环境中会迅速转变成晶型Ⅰ，特别考虑到采用湿法制粒的制剂过程中，会转变成晶型Ⅰ。因此，在晶型Ⅰ工业生产过程中，需严格控制干燥条件，以免变成混合晶型，对制剂生产过程及溶出特性、稳定性等产生影响，而晶型Ⅱ则不适合作为药用晶型。通过DSC热循环方法证实了在常温常压条件下，乳酸左氧氟沙星无水晶型难以存在。
《中国药典》2004年版未明确乳酸左氧氟沙星多晶型现象，其中该分子结构式显示为半水合物，但是在水分测试中规定不大于6%，这与半水合物的理论水含量(1.96%)相差较大，水分规定范围过于宽泛，不能有效区分一水合物晶型和半水合物晶型。根据稳定性研究结果，乳酸左氧氟沙星一水合物晶型更适合作为药用晶型。
本研究建立的乳酸左氧氟沙星不同晶型的鉴别方法和初步稳定性研究，将为该药物的晶型控制提供基础数据和依据。
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