ω-3脂肪酸甘油三酯(omega-3-acid-triglycerides)，富含长链ω-3脂肪酸，主要为二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，是ω-3鱼油脂肪乳注射液的主要原料。ω-3鱼油脂肪乳可以为机体提供所需脂肪，还可显著改善肝损伤^[1-2]，并有调节免疫应答和降低机体的炎症反应的作用^[3-6]，临床上经常作为肠外营养补充剂，为无法正常进食或摄取量不足的患者提供营养和能量，也用于某些心血管疾病、神经系统疾病、感染性疾病的辅助治疗。现行版《中华人民共和国药典》和JP16均未收载，USP、BP和EP^[7-9]均有收载，但未制定细菌内毒素检查项。细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，对哺乳动物有致热、致死等多种生物活性，考虑本品作为肠外给药制剂，应制定细菌内毒素检查项。

鲎试剂与内毒素的反应一般都是在水溶液中进行，ω-3脂肪酸甘油三酯不溶于水，细菌内毒素检查无法正常进行。曾报道^[10-12]用水振荡混匀后取水层进行细菌内毒素检查，或用乙醇、二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)等溶解样品^[13-17]，或加入表面活性剂助溶进行细菌内毒素检查^[18]。本文考察了三氯甲烷溶解后加水振荡萃取的方法，并对该方法进行较详细的研究，为细菌内毒素检查提供依据。

1 仪器与材料

电热干燥箱(DHG-9075A型)，上海一恒科技有限公司；漩涡混合器(Digital型)，德国IKA公司；试管恒温仪(TAL-40D型)，湛江安度斯生物有限公司；电子天平(XS204型)，赛多利斯有限公司；台式冷冻离心机(Allegra X-30R型)BECKMAN公司。

ω-3脂肪酸甘油三酯原料药(批号0001121836、0001133439、0001054806)；鲎试剂1(湛江博康海洋生物有限公司，规格0.1 mL·支^-1，批号1604280，灵敏度0.25 EU·mL^-1)；鲎试剂2(湛江安度斯生物有限公司，规格0.1 mL·支^-1，批号1605302，灵敏度0.25 EU·mL^-1)；细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院，批号150601-201681，规格80 EU·支^-1)；细菌内毒素检查用水(BET水)(湛江博康海洋生物有限公司，批号1602010，规格5 mL)；三氯甲烷(天津市科密欧化学试剂有限公司，规格：500 mL，批号20160805，分析纯)；二甲基亚砜(DMSO)(北京百灵威科技有限公司，规格：500 mL，批号LE20Q60，HPLC级，纯度99.9%)。

2 方法与结果 2.1 细菌内毒素限值的确定

ω-3脂肪酸甘油三酯临床用药最大注射剂量为15 mg·(kg·h)^-1，限值计算如下式：

$ L=K/M=\frac{5\text{EU}\cdot {{\left( \text{kg}\cdot \text{h} \right)}^{-1}}}{15\text{mg}\cdot {{\left( \text{kg}\cdot \text{h} \right)}^{-1}}}=0.33\text{EU}\cdot \text{m}{{\text{g}}^{-1}} $

根据《注射剂安全性检查法应用指导原则》的要求^[19]，为确保临床用药安全，将其限值(L)拟订为0.1 EU·mg^-1。

2.2 鲎试剂灵敏度复核

经复核，所用鲎试剂灵敏度的测定值(λ_C)均在0.5 λ~2.0 λ之间，结果均符合规定。

2.3 供试品稀释浓度范围

目前市售鲎试剂灵敏度(λ)范围一般在0.5~0.03 EU·mL^-1之间，L为0.1 EU·mg^-1，最小有效稀释浓度MVC=λ/L。因此，ω-3脂肪酸甘油三酯进行细菌内毒素检查时，0.5~0.03 EU·mL^-1的鲎试剂相对应ω-3脂肪酸甘油三酯最小有效稀释浓度为5.0~0.3 mg·mL^-1。

2.4 三氯甲烷作为溶剂对细菌内毒素的影响 2.4.1 三氯甲烷饱和水溶液的干扰试验

取三氯甲烷1 mL，加入BET水1 mL漩涡混匀，静置30 s，取上清液制成三氯甲烷饱和水溶液，使用灵敏度为0.25 EU·mL^-1的鲎试剂进行干扰试验。用BET水和三氯甲烷饱和水溶液，分别将细菌内毒素工作标准品稀释成0.5、0.25、0.125、0.0625 EU·mL^-1系列浓度的溶液。同时，分别用BET水和三氯甲烷饱和BET水溶液做阴性对照进行试验，计算E_s和E_t。结果表明，E_s均在0.5 λ~2.0 λ范围内，三氯甲烷饱和水溶液的E_t均在0.5 λ~2.0 λ范围内，说明三氯甲烷饱和水溶液对鲎试剂与细菌内毒素的反应无干扰作用。

2.4.2 三氯甲烷加标回收试验

取细菌内毒素工作标准品1支，加入DMSO溶解制成浓度为100 EU·mL^-1的溶液。取上述溶液10 µL，加入三氯甲烷2 mL充分混匀，加入BET水2 mL漩涡混匀，静置30 s，取上清液(内毒素浓度为0.5 EU·mL^-1)，将上清液稀释制成浓度分别为0.25、0.125和0.06 EU·mL^-1的系列溶液，使用灵敏度为0.25 EU·mL^-1的鲎试剂进行试验。结果回收率为84%，表明三氯甲烷对细菌内毒素含量没有影响。

2.5 ω-3脂肪酸甘油三酯内毒素检查 2.5.1 干扰预试验

精密称取ω-3脂肪酸甘油三酯，加入三氯甲烷2 mL使溶解，分别加入不同体积的BET水，萃取制成相当于供试品质量浓度为10.0、5.0、2.5 mg·mL^-1的系列溶液作为供试品溶液(NPC)，同时每一浓度下均制备含有2λ细菌内毒素的系列溶液作为供试品阳性对照(PPC)，并设阳性对照(PC)和阴性对照(NC)。结果，ω-3脂肪酸甘油三酯浓度在相当于10 mg·mL^-1以下时，对λ为0.25 EU·mL^-1的鲎试剂与细菌内毒素的反应均无干扰作用。

2.5.2 正式干扰试验

用λ为0.25 EU·mL^-1的2个厂家的鲎试剂进行检查，测定用BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值(E_s)和用供试品制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值(E_t)。精密称取ω-3脂肪酸甘油三酯20 mg，加入三氯甲烷2 mL溶解，再用BET水萃取制成相当于5 mg·mL^-1的供试品溶液，用BET水和供试品溶液分别将细菌内毒素工作标准品稀释成2 λ、λ、0.5 λ和0.25 λ浓度的BET水系列细菌内毒素溶液和供试品系列细菌内毒素溶液，同时用上述供试品溶液和BET水各做阴性对照管，计算E_s和E_t，结果见表 1。结果E_s均在0.5 λ~2.0 λ范围内，供试品的E_t均在0.5λ~2.0λ范围内，说明供试品在相当于5 mg·mL^-1或更低浓度时，对2个不同厂家的鲎试剂与细菌内毒素的反应无干扰作用。

2.5.3 供试品回收率试验

精密称取供试品10、20 mg，分别加入“2.4.1“项下细菌内毒素工作标准品溶液10、20 µL混匀，加入三氯甲烷2 mL溶解，加入BET水萃取制成细菌内毒素浓度均为0.5 EU·mL^-1的溶液，然后用BET水稀释1、2、4、8倍(终点稀释倍数)。采用湛江博康海洋生物有限公司生产的灵敏度为0.25 EU·mL^-1的鲎试剂，对供试品进行加标回收试验，结果供试品回收率均在50%~200%之间，见表 2。

2.5.4 供试品细菌内毒素检查

取ω-3脂肪酸甘油三酯3批，按“2.5.1”项下方法制成相当于浓度为2.5 mg·mL^-1的供试品溶液，用λ为0.25 EU·mL^-1的2个厂家的鲎试剂进行细菌内毒素检查，并用此溶液将细菌内毒素工作标准品稀释为2 λ的溶液，作为供试品的阳性对照；另外以BET水建立阳性对照和阴性对照进行检查^[2]。结果，阴性对照管均为阴性，供试品阳性对照管和阳性对照管均为阳性，试验有效；供试品管均为阴性，表明样品中所含细菌内毒素未超过限度规定，细菌内毒素检查均符合规定。

3 讨论

ω-3脂肪酸甘油三酯为油状液体，在水中几乎不溶，为测定其中的细菌内毒素，需将供试品与BET水充分振荡混匀，制备混悬液进行内毒素测定。本研究曾参考文献^[10-11]，采用在ω-3脂肪酸甘油三酯中加入BET水，漩涡振荡分散均匀后，2 500 r·min^-1离心10 min后，取下层溶液制备供试品溶液。由于ω-3脂肪酸甘油三酯密度小，与水混合后在上层，离心后下层管壁有明显的细小油状供试品贴壁，取样时不小心容易取出，不仅操作复杂，且操作不当易导致结果假阳性，重现性差；而离心增加了操作步骤，易污染，导致结果不可靠。采用月桂醇聚醚-10(C₁₂E₁₀)等非离子表面活性剂溶解、制备样品，需要稀释较大倍数才能消除溶剂的干扰，且需采用灵敏度高的鲎试剂进行实验^[13]。

曾有报道^[20]采用三氯甲烷萃取水溶液中的脂，结果萃取不影响供试品中内毒素的含量，同时参考经典的细菌内毒素提取苯酚-三氯甲烷-石油醚法(PCP法)，选取与ω-3脂肪酸甘油三酯互溶，且密度比水大的三氯甲烷溶解样品，使ω-3脂肪酸甘油三酯溶解于三氯甲烷层，取上层水溶液检查。干扰试验和回收率结果证明，三氯甲烷对内毒素活性和含量无干扰。该方法如果用水饱和三氯甲烷溶解样品，可减少乳化的发生，更有利于消除干扰，保证试验结果。

DMSO与水、乙醇、丙醇和三氯甲烷等混溶。加标回收试验中，用DMSO溶解细菌内毒素工作标准品，可使细菌内毒素均匀分散于样品中，然后依次用三氯甲烷溶解、水提取。回收试验结果表明，以萃取后的水相溶液做细菌内毒素检查，能够较准确反映ω-3脂肪酸甘油三酯中的细菌内毒素含量，也为水中不易溶解的弱极性原料药细菌内毒素检查提供参考。