2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
氟虫腈(fipronil)是一种苯基吡唑类的广谱杀虫剂[1]，由法国罗纳-普朗克公司研发[2]，作用于昆虫的γ-氨基丁酸受体，干扰昆虫中枢神经，引起昆虫神经和肌肉过度兴奋直至死亡，从而起到杀虫作用。氟虫腈对鳞翅目、蝇类和鞘翅目等一系列害虫具有很高的杀虫活性[3]，然而，在使用过程中，氟虫腈逐渐表现出很多毒副作用。研究表明，氟虫腈对甲壳类水生生物和蜜蜂风险极高，尤其是对蜜蜂，当蜜蜂把带有氟虫腈的花粉带回蜂巢后，会导致整个蜂巢内幼虫全部死亡。在对人体毒性方面，温州某医院曾有过2例关于氟虫腈急性中毒的病患报道，其中1例由于食用了被氟虫腈污染的菜叶，患者出现四肢抽搐、精神异常、胡言乱语、狂躁等中枢神经系统兴奋症状[4]。
我国于2009年发布农业部1157号公告，规定除卫生用、部分旱田种子包衣剂外，在中国境内停止销售和使用用于其他方面的含氟虫腈成分的农药制剂。然而，食品安全国家标准GB2763-2016[5]仅对谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、糖料和食用菌6项农作物中氟虫腈的残留量进行了规定，最大残留限量为0.02 mg·kg-1，对畜禽产品中的氟虫腈最大残留限量没有明确规定。同时，目前还没有相关的国家标准或行业标准涉及动物源性食品中氟虫腈残留的检测方法。欧盟395/2005号法规[6]以及1127/2014补充条例[7]中，明确规定了各种农作物、畜禽产品及其制品(包括肉、蛋、奶、蜂蜜等)中氟虫腈的最大残留限量，其中牛奶的限量为0.005 mg·kg-1。
氟虫腈在动物、植物、环境中会代谢生成与氟虫腈相当或毒性更高的砜化物或亚砜化合物[1]，GB2763-2016和欧盟法规中规定，食品中氟虫腈的残留量以氟虫腈及其3种代谢物[氟甲腈(fipronil-desulfiny)、氟虫腈硫醚(fipronil sulfide)、氟虫腈砜(fipronil sulfone)]之和计算。
目前，关于氟虫腈及其代谢物的检测方法主要有气相色谱-质谱法[8]、液相色谱法[9]和液相色谱-质谱法[10-11]，但是这些方法主要针对的是蔬菜、水果或者环境水体中的氟虫腈及其代谢物残留检测，Zhang等[11]于2016年针对鸡蛋和鸡肉中的氟虫腈残留建立了LC-MS/MS分析方法，但仅涉及氟虫腈原形药物，未涉及其代谢物的分析。有关生鲜牛乳中氟虫腈及其代谢物的分析未见报道。
本研究建立了一种高效简便的分析生鲜牛乳中氟虫腈及其代谢物残留的方法，前处理简单快速，方法灵敏度高，适合高通量样品的快速检测分析。
1 仪器与试药Thermo Q-ExtractiveTM液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用仪，含高压二元泵、自动进样器、柱温箱、四极杆-静电场轨道阱质量分析器、Xcalibur 3.1数据分析系统；Heraeus Multifuge X1R离心机，Thermo公司；固相萃取装置(含无油隔膜真空泵)，Waters公司；MS3 basic涡旋仪，IKA公司；KS501振荡器，IKA公司；N-EVAPTM112氮吹仪，Organomation公司；LINK BLOW氮气发生器，金浪科技有限公司。
甲醇、乙腈，色谱纯，Merck公司；乙腈，分析纯，南京化学试剂有限公司；甲酸，LC-MS级，Fisher公司；纯净水，自制。固相萃取净化柱(Captiva ND lipids，60 mg/3 mL)，Agilent公司。
对照品纯度及来源：氟虫腈(99.2%，Dr.Ehrenstorfer)，氟甲腈[101 μg·mL-1(±3%)，北京曼哈格生物科技有限公司]，氟虫腈硫醚(99.0%，Dr.Ehrenstorfer)，氟虫腈砜(98.2%，Dr.Ehrenstorfer)。
2 溶液制备取氟虫腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜对照品各适量，精密称定，用乙腈溶解并定容于100 mL量瓶中，制成100 μg·mL-1的对照品储备液，转移至棕色玻璃瓶中，于4 ℃冷藏保存；精密量取氟甲腈对照品1 mL于100 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成1 μg·mL-1的对照品储备液，转移至棕色玻璃瓶中，于4 ℃冷藏保存。
取氟虫腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜对照品储备液各1.0 mL，置100 mL量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到1 μg·mL-1混合对照品溶液。
取氟虫腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜1 μg·mL-1混合对照品溶液和氟甲腈对照品储备液各1.0 mL，置100 mL量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到10 ng·mL-1混合标准溶液。
3 样品前处理称取2 g(精确至0.01 g)生鲜牛乳样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入乙腈10 mL，涡旋使之充分混合，振荡提取30 min，4 ℃下10 000 r·min-1离心5 min，上清液备用固相萃取净化。
Captiva ND lipids固相萃取柱，取2.5 mL上清液上样，通过真空泵负压，收集滤液于氮吹管中，50 ℃水浴下氮气流吹干，用1 mL乙腈- 0.1%甲酸(50：50)溶液复溶溶解残渣，超声15 min，涡旋1 min，待测。
4 液相色谱-质谱条件 4.1 色谱条件色谱柱：Waters HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相A：0.1%甲酸，流动相B：乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脱条件见表 1；流速：0.3 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
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表 1 梯度洗脱条件 Tab.1 Parameters of gradient elution |
质谱分析采用平行反应监测模式(parallel reaction monitoring，PRM)。测试前使用Thermo Pierce负离子校正液在m/z 265.147 90、514.284 40、1 279.997 21、1 379.990 83、1 479.984 44、1 579.978 05、1 679.971 66、1 779.965 28处校正，校正有效期维持在3 d内。质谱参数：喷雾电压：-4 500 V，雾化气：40 L·h-1，辅助气：15 L·h-1，离子传输温度：350 ℃，辅助加热温度：400 ℃。分辨率：17 500，AGC target：5×104，C-trap最大注入时间：50 ms。目标物及其定量子离子的精确质量数见表 2。
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表 2 氟虫腈及其3种代谢物定性及定量离子信息 Tab.2 Qualitative and quantitative information of fipronil and its 3 metabolites |
空白生鲜牛乳样品被用来评价方法学参数。使用空白生鲜牛乳样品制备一系列浓度的基质标准曲线评价方法的线性和范围，按信噪比(S/N)为3确定检测下限(LOD)，按S/N为10确定定量下限(LOQ)。通过向空白样品中添加1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ的被测物，并平行测定多次，来考察日内精密度和日间精密度，通过测得值与实际添加值的比较，计算回收率。
6 结果与讨论 6.1 液相色谱柱与流动相的选择和优化根据氟虫腈及其3种代谢物的化学结构，采用常规的C18柱即可有效分离，本研究中采用1.8 μm粒径C18柱，柱效高，分离速度快；流动相体系采用乙腈-0.1%甲酸水溶液，乙腈黏度较小，可以有效降低色谱体系压力。实际分析过程中发现，4种待测物极性较小，保留较强，需要较高比例的有机相才能洗脱。在初始流动相设置为50%乙腈时，4种待测物在5~6 min内逐步洗脱，保留时间是死时间的5倍以上，并且均获得良好的峰形。有研究表明[13]，负离子模式下少量甲酸的加入不仅不会抑制电离，反而有改善峰形，增强响应的效果，但甲酸引入过多，会与待测物产生竞争效应。本研究中采用乙腈和低浓度甲酸水溶液作为流动相，检测灵敏度可以达到0.5 μg·kg-1，并且峰形尖锐，在保证灵敏度的前提下获得很好的色谱保留和分离效果(图 1)。
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1.氟虫腈(fipronil) 2.氟甲腈(fipronil-desulfinyl) 3.氟虫腈硫醚(fipronil sulfide) 4.氟虫腈砜(fipronil sulfone) 图 1 氟虫腈及其3种代谢物对照品溶液(1 ng·mL-1)的色谱图 Fig.1 Chromatograms of reference substance solution of fipronil and its 3 metabolites(1 ng·mL-1) |
基于串联四极杆的选择性反应监测模式(selective reaction monitoring，SRM)或多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)，经多年实践已成为定量分析的黄金标准，在目标靶向物分析中获得了良好的选择性、灵敏度、特异性和重现性。虽然SRM分析方法被广泛接受，但仍然存在着一些局限性：低分辨率的四极杆质量分析器在复杂的生物样品基质中不能提供足够的选择性；残留分析中，要求LC-MS/MS在定性上提供1个母离子和2个子离子，才能满足欧盟2002/657/EC[12]规定中的“4分要求”，但是部分化合物在复杂基质中不易同时产生2个子离子碎片。近年推出的具有快速二级质谱功能的高分辨质谱如最新一代的四极杆-静电场轨道阱质谱(quadrupole-Orbitrap，Q-Orbitrap)使得开发新的定量方法成为可能。
平行反应监测模式(parallel reaction monitoring，PRM)是相对于传统的SRM建立起来的高分辨子离子监测技术，属于靶向MS/MS分析，和SRM只检测目标离子对的模式不同，PRM在整个液相分离过程中会在给定电压下不断地对每一个目标母离子的全部碎片离子图谱进行记录，而且是全部高分辨/高质量精度子离子。和经典的SRM方法相比，PRM提供更高的专属性，因为它在高分辨的模式下监测子离子，很少受到干扰离子的影响，因而，PRM具有方法开发的潜在优势。
根据欧盟2002/657/EC规定，当使用高分辨质谱对化合物进行定性确证时，1个母离子2分，1个子离子2.5分。本研究在PRM模式下选择1个母离子和1个子离子进行定性和定量分析，均超过欧盟的4分规定，定性定量结果准确可靠。
6.3 离子检测参数的选择及定量子离子的确定本研究中的目标物，氟虫腈及其3种代谢物化学结构中均含有-Cl、-F等电负性较强的基团，因此在负离子模式下，目标物易失去H得到[M-H]-峰。在本研究中，采用蠕动注射泵将100 ng·mL-1的对照品溶液注射入离子源，在负离子模式下分别进行了一级全扫描和二级质谱扫描，通过手动调节碰撞能量，获得不同碰撞能量下的子离子扫描图，选择母离子的相对丰度约为5%时的碰撞能量作为实际测试用碰撞能量，选择此碰撞能量下丰度最大的子离子作为定量子离子。本研究中的4种目标化合物，均在HCD电压为20 eV时获得较为理想的子离子信息。详细的碰撞能量和定量子离子信息见表 2。
6.4 样品前处理方法的选择乙腈是一种常用的提取溶剂，有较高的提取效率和蛋白沉淀能力，而本研究中涉及的生鲜牛乳基质，其中脂肪和蛋白质含量较高，仅用乙腈提取的方法，对样品的净化程度不够，不仅会对待测物产生干扰，同时也对色谱及质谱系统有一定伤害。常用的固相萃取方法一般需经过活化、上样、淋洗和洗脱4个步骤，整个流程时间较长，对于脂肪含量较高的基质更是容易产生柱孔隙堵塞的现象。
本研究选用Captiva ND lipids柱净化。Captiva ND lipids柱是一种新型的样品净化柱，专门设计用于去除生物样品中的磷脂、蛋白质等基质干扰，从而显著降低了离子抑制效应，离子源更洁净，提高了痕量物质分析方法的灵敏度、精确性和重现性。同时，脂类物质的去除，也可以在很大程度上改善色谱峰形，延长色谱柱寿命，并提高保留时间重现性，更容易实现分析方法规程的标准化。在使用过程中，Captiva ND lipids柱被设计成一种“无滴落”技术和方式，将生鲜牛乳的乙腈提取液转移到Captiva ND lipids柱管内后，柱管底部0.2 µm孔径的过滤器能够保证样品提取液不会自由滴落，通过在固相萃取装置上额外设置的0.024~0.051 MPa的负压，样品提取液通过柱底部的过滤器，提取液中的被测化合物被收集到氮吹管中，经后继的浓缩步骤而被测定，提取液中的磷脂、蛋白质等基质干扰物质则被过滤器中的特定材料吸附而保留在净化柱上。可见，简单的2步操作，结合Captiva ND Lipids的快速吸附技术，确保了较高的样品通量，同时对于许多样品，几乎免除了进行方法开发的必要，从而提高了分析效率。
结果表明，经Captiva ND Lipids柱净化的样品回收率明显优于不经净化的样品，并且方法的平行性及精密度有较明显的提高；Captiva ND lipids柱的净化方式在快速净化的同时尽可能避免了损失，这种前处理方式无需活化和淋洗过程，进样量小，速度快，整个净化过程仅需5 min完成，能够有效除去样品中超过95%的磷脂和蛋白组分，基质干扰在可以接受的范围内，大大缩短了前处理时间，适合大批量样品的筛查工作。
6.5 方法学验证 6.5.1 专属性标准溶液的色谱图见图 1，空白生鲜牛乳的色谱图见图 2，生鲜牛乳中阳性添加(添加量为1 µg·kg-1)色谱图见图 3。如图可知，空白生鲜牛乳样品中不含干扰测定的物质；阳性添加样品中，4种目标化合物保留时间在5.0~6.0 min之间，且峰形良好。同时获得了氟虫腈及其3种代谢物的子离子扫描图(图 4)，其特征碎片离子的可能结构见图 4，在定量测定的同时，可以和标准品图谱比对，进行定性判定。
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图 2 空白生鲜牛乳的色谱图 Fig.2 Chromatograms of blank raw milk |
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1.氟虫腈(fipronil) 2.氟甲腈(fipronil-desulfiny) 3.氟虫腈硫醚(fipronil sulfide) 4.氟虫腈砜(fipronil sulfone) 图 3 生鲜牛乳中氟虫腈及其3种代谢物阳性添加(1 µg·kg-1)的色谱图 Fig.3 Chromatograms of blank raw milk spiked with fipronil and its 3 metabolites at 1 µg·kg-1 |
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图 4 同时获得的氟虫腈及其3种代谢物的子离子扫描图 Fig.4 Mass spectra of product ion of fipronil and its 3 metabolites |
准确称取空白生鲜牛乳样品2 g，分别置于50 mL聚丙烯塑料离心管中，分别加入混合标准溶液适量，制成一系列的梯度添加试样，按“样品前处理”步骤处理试样后，进行LC-HRMS测定。以试样的药物添加浓度为横坐标，以各化合物峰面积为纵坐标，进行标准曲线的绘制，按照“样品前处理”项下建立的方法进行添加实验，以目标化合物的信噪比计算得到检测下限和定量下限，结果见表 3。
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表 3 生鲜牛乳中氟虫腈及其3种代谢物基质标准曲线 Tab.3 The matrix calibration curve of fipronil and its 3 metabolites in raw milk |
分别称量生鲜牛乳的空白样品，进行氟虫腈及其3种代谢物的1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ这3个浓度的加标回收实验，并且在每个浓度水平进行5次平行实验，分别考察3 d，根据检测结果计算回收率，并用RSD评价日内和日间精密度，结果见表 4。
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表 4 生鲜牛乳中氟虫腈及其代谢物检测的回收率和精密度(%) Tab.4 Recovery and precision of fipronil and its metabolites in raw milk |
从表 4可以发现，在低、中、高3个浓度，生鲜牛乳中氟虫腈及其3种代谢物的回收率均在85%~115%之间，日内、日间精密度均小于15%。
6.5.4 实际样品的分析对江苏省畜产品质量检验测试中心留存的部分生鲜牛乳样品进行了筛选测试，尚未检出氟虫腈及其代谢物残留。
7 结论本研究建立了生鲜牛乳中氟虫腈及其代谢物(氟甲腈、氟虫腈硫醚和氟虫腈砜)LC-HRMS检测方法，样品经提取、Captiva ND lipids柱净化，用LC-Q-Orbitrap MS测定，PRM模式检测，本方法灵敏度高、专属性强，简便、高效，适用于生鲜牛乳中氟虫腈及其代谢物的快速筛查、定性筛选和定量测定。
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