随着社会竞争的日趋激烈和生活节奏的加快，失眠已经成为不可忽视的社会问题，改善睡眠类的保健品也在市面上层出不穷。目前经原国家食品药品监督管理总局批准上市的宣称具有改善睡眠作用的保健食品中，部分以褪黑素为原料，还有一部分以药食同源物质如酸枣仁(炒)、茯苓、首乌藤、熟地黄、五味子为原料。然而，许多不法分子利用消费者急需见效的消费心理，通过添加各种镇静催眠类药品，欺骗消费者。这些药物的使用剂量在临床上有严格的规定，使用不当会导致严重的不良反应^[1]。

目前用于保健食品非法添加的筛查方法主要有薄层色谱法^[2]、HPLC法^[3]、HPLC-MS法^[4-6]等，这些方法存在筛查不全面、检测时间长、容易出现假阳性结果等不足。四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪具有优秀的定量分析能力和高分辨率，对化合物的分辨率可达100 000，相对质量偏差在0.1~5×10^-6之间^[6-10]。通过全扫描/数据依赖的二级扫描(Full MS/dd-MS²)模式，在1个分析周期(10 min)内完成对样品的高精度一级、二级扫描，得到准确质量数(accurate mass，AM)和准确碎片离子信息，同时对潜在的阳性样品进行定量分析。

本研究选择了改善睡眠类保健品中常见添加的18个化学药物^[11-12][包括苯二氮䓬类(地西泮、劳拉西泮、氯硝西泮)、巴比妥类(巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥)、催眠药(氯美扎酮)]等作为研究对象，建立了UPLC-Q-Orbitrap分析方法，并进行了方法学验证。通过对10种改善睡眠类保健品(包括胶囊剂、丸剂、片剂等不同基质)的检测，证明本研究建立的方法可有效地应用于改善睡眠类保健品中非法添加药物成分的快速筛查和准确定量。

1 仪器与试药 1.1 仪器

四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Q-Exactive，ThermoFisher Scientific公司)，配有HESI-Ⅱ源；液相色谱系统为Dionex Ultimate 3000超高压液相色谱(美国Dionex公司)；CF16RXII离心机(日本Hitachi公司)；SAS涡旋混合器(英国Stuart公司)；KQ3200超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

对照品褪黑素、艾司唑仑、氯氮卓、氯美扎酮、咪达唑仑、奥沙西泮、劳拉西泮、地西泮、阿普唑仑、氯硝西泮、马来酸氯苯那敏、盐酸氯丙嗪、硝西泮、三唑仑、司可巴比妥钠、巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥(纯度均≥98.5%，中国食品药品检定研究院)；甲醇和乙腈(HPLC级，美国Fisher公司)；其他试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。实验用水为经Milli-Q净化系统过滤的去离子水。

10种改善睡眠类保健食品：基质包括胶囊、丸剂以及片剂等，来源于市场抽检样品。

2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品溶液

分别准确称取对照品适量，用纯甲醇溶解，配制成2 mg·mL^-1的对照品储备液，于4 ℃保存。分别准确移取上述18个单一成分对照品储备液适量，用50%乙腈稀释成5个浓度的工作溶液，于4 ℃保存。

2.1.2 供试品溶液

取保健品胶囊样品的内容物、丸剂以及片剂各适量，置于研钵中碾磨均匀成粉末状。分别准确称取粉末1.0 g，置于50 mL量瓶中，加入60%甲醇40 mL，20 ℃超声(35 kHz，600 W)15 min，于10 000 r·min^-1离心5 min。取适量溶液，经0.22 μm滤膜过滤至进样瓶中，供高效液相-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪测定。

2.1.3 阴性样品溶液

取具有代表性的胶囊剂、丸剂、片剂3种剂型阴性样品各2份，按上述方法分别制成胶囊剂、丸剂、片剂的空白基质粉末，分别称取1.0 g，置于50mL量瓶中，参照“2.1.2”项下方法制备3种剂型的阴性样品溶液。

2.2 实验条件

色谱条件：Water HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相由A相(含2 mmol·L^-1乙酸铵和0.2%甲酸水溶液)和B相(0.1%甲酸乙腈溶液)组成，梯度洗脱(0~1 min，35%B；1~7 min，35%B→85%B；7~7.5 min，85%B→35%B；7.5~10 min，35%B)，流速：0.30 mL·min^-1；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

质谱条件：可加热的电喷雾离子源(HESI-Ⅱ)；毛细管温度为320 ℃，加热温度为350 ℃，鞘气(N₂)流速35 L·min^-1，辅助气(N₂)流速10 L·min^-1；喷雾电压为3.5 kV，透镜电压为55 V；采用正、负离子同时扫描的Full MS-data dependent MS²(dd-MS²)模式；全扫描的分辨率R=17 500，扫描范围m/z 150~500，dd-MS²扫描的分辨率R=17 500；AGC target：1×10⁵；最大驻留时间：50 ms；分离窗口：m/z 4.0；强度阈值：2×10⁴。具体分析物质的准确质量数及碎片离子、碰撞能、保留时间、分离模式如表 1所示。

2.3 专属性考察

取“2.1.3”项下阴性样品溶液各5 μL，按“2.2”项下色谱和质谱条件进样，得到3种阴性样品溶液的色谱和质谱图，均未见有干扰18个目标物成分的色谱峰。结果表明，上述3种剂型中所含有的中药成分均不干扰目标物的测定，方法专属性良好。

2.4 线性关系考察

采用Q-Orbitrap对18个非法添加的改善睡眠药物进行定量分析，用50%乙腈稀释标准工作溶液，得到合适浓度的系列标准溶液。目标物母离子的色谱峰面积(Y)为纵坐标，以目标物的浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。所有化合物在标准曲线范围内线性良好，相关系数(r)大于0.993。在空白片剂样品中添加低浓度目标物，以信噪比S/N=3时对应的浓度为方法的检测下限，见表 2。

2.5 回收率试验

取胶囊剂、丸剂、片剂的空白基质各3份，平行2份，每份称取1.0 g，分别置50 mL量瓶中，加入混合对照品溶液各适量，同“2.1.2”项下方法制备供试溶液，分别进行0.5、2.0以及5.0 mg·kg^-1 3个添加水平的回收率试验。测得18个改善睡眠药物的加标回收率为72.2%~118.7%。

2.6 精密度试验

日内精密度和日间精密度均采用添加水平为0.5 mg·kg^-1的空白样品，日内精密度由每隔2 h重复实验6次测得，日间精密度连续3 d重复取样测得。结果日内精密度RSD控制在2.4%~5.4%之间，日间精密度RSD控制在2.6%~9.2%之间。方法精密度良好。

2.7 样品测定

利用本方法分别对10种改善睡眠类保健品进行了检测，其中有6批次样品检出褪黑素成分，样品中褪黑素浓度范围从3.8 mg·g^-1到12 mg·g^-1不等，与其配方标识值一致，均属于合格样品。

3 讨论 3.1 色谱柱的选择

本实验考察了UPLC系统中常用的C₁₈色谱柱Waters BEH C₁₈柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。结果表明，Waters HSS T3柱分析强极性化合物时保留效果较好，分析化合物时的理论塔板数较高，且化合物的峰形完好。故本研究选用Waters HSS T3柱进行进一步的色谱条件优化。

3.2 液相色谱条件的优化

为了获得较好的分离效果，发现在流动相水相中增加2 mmol·L^-1乙酸铵能够改善部分分析物峰形，且能提高靶标物质离子化效率，从而增强化合物响应。其次，本实验中部分化合物有拖尾现象，如氯氮䓬、咪达唑仑等，考虑到乙腈比甲醇洗脱能力强，所以用乙腈作为流动相降低拖尾现象。因此本研究选用A相(含2 mmol·L^-1乙酸铵和0.2%甲酸水溶液)和B相(0.1%甲酸乙腈溶液)为流动相。对于18种化合物的分离，选择梯度洗脱程序，在10 min内所有化合物都能够得到较好的分离。图 1、2为改善睡眠类药物标准溶液的提取离子流图。

3.3 质谱条件的优化

本研究充分利用Q-Orbitrap高分辨质谱的优势，采用Full MS/dd-MS²模式进行分析。该扫描模式包含2个扫描事件：首先进行一级全扫描，然后对指定的母离子做MS²扫描。本文采用正、负离子同时扫描的检测方式，18个化合物中，司可巴比妥钠、巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥为负离子模式检测，其余14个化合物均在正离子模式下检测。高分辨率可带来更好的质量精度，但同时也会降低响应的灵敏度并减少采集的扫描点数。对于正、负离子的同时检测，建议设置较低的分辨率，因此本研究在一级和二级扫描时都选用分辨率R=17 500。在此分辨率下，各化合物的灵敏度较好，色谱峰扫描点数均大于12个点，质量偏差均小于5×10^-6，基本满足定性和定量的分析要求。本研究通过流动注射直接进入质谱，分析并优化每种物质的离子化方式及碰撞能量。表 1列举了每种分析物的碰撞能、理论质量数和实测质量数，质量偏差都小于5×10^-6，表明Q-Orbitrap高分辨质谱在理论质量数和实测质量数之间可以提供高的可信度。

3.4 谱库的建立

根据以上的实验条件，分别对18个改善睡眠药物进行质谱数据采集，利用得到的质谱数据建立18个药物的二级质谱图谱库。图 3、4是18个改善睡眠药物标准溶液的二级质谱图。在实际样品分析中利用一级质谱的精确质量数和二级质谱图比对，可实现对改善睡眠类保健品样品的靶标筛查和定性确认。

3.5 小结

利用Q-Orbitrap液相色谱-质谱联用系统建立了改善睡眠类保健品中18个非法添加化学药的快速筛查和定量分析方法。高分辨质谱的使用减少了样品中的基质干扰，显著提高了定性和定量结果的准确性；通过比对目标物质的碎片质谱图，有效提高了定性的准确性。本方法过程简便，分析时间短，测定结果准确，大大提高实验室的检测效率，能够满足保健品中18个非法添加改善睡眠药物的快速筛查与定量分析。