2019, Vol. 39 
表1(Table 1)
2. 浙江省食品药品检验研究院, 浙江省药品接触材料质量控制研究重点实验室, 杭州 310052
2. Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Key Laboratory of Drug Contacting Materials Quality Control of Zhejiang Province, Hangzhou 310052, China
盐酸头孢他美酯为第三代口服广谱头孢菌素类抗生素, 口服后在体内迅速被水解为有抗菌活性的头孢他美, 从而发挥杀菌作用, 因为其抗菌能力强以及对β-内酰胺酶耐受性好, 在临床上应用广泛[1-4]。近年来, β-内酰胺类抗生素的不良反应, 尤其是速发过敏反应引起了医药界的高度重视。多年的临床研究证明, 引发过敏反应的过敏原是其中的高分子杂质, 因此, 对该类药物中杂质的研究和控制, 是减少其不良反应的重要手段[5-6]。
文献报道, 盐酸头孢他美酯及其制剂中有关物质测定多采用HPLC法[7-10]。李丹凤等[2]采用质谱法鉴别出盐酸头孢他美酯分散片中的10个有关物质, 其中包括小分子杂质以及高分子二聚物。本课题组成员前期采用飞行时间质谱和离子肼质谱鉴定出了盐酸头孢他美酯原料药中的10个有关物质, 并推测了可能的裂解途径[11], 查阅国内外相关文献, 均无采用核磁共振法对其中可能的杂质进行结构确证的相关报道。
ICH Q3a对新药中杂质的控制规定:新原料药中≥0.1%的有机杂质, 应对其结构特征进行描述[12]。前期课题组成员已初步对盐酸头孢他美酯原料药中的杂质进行了质谱鉴定[10], 本次研究将盐酸头孢他美酯原料药中含量较大、与相邻杂质分离较好的3个杂质进行分离制备, 并测定其核磁、红外光谱等光谱数据, 结合质谱信息, 对制备出的杂质进行结构确证, 并进行位置归属。本研究分离制备并鉴定了盐酸头孢他美酯中的有关物质, 特别是高分子聚合物, 对进一步控制其质量, 研究不良反应的产生原因, 减少不良反应具有实际指导意义。
1 仪器与试药Agilent 1260型高效液相色谱仪（二元泵, Agilent G1313自动进样器, VWD和Chemstation工作站, Agilent公司）, Thermo AcclaimTM 120 C18色谱柱（4.6 mm×250mm, 5 μm; 填料:十八烷基硅烷键合硅胶）; Agilent Prestart SD-1型制备液相色谱（二元泵, VWD和Chemstation工作站, Agilent公司）, Agilent Prep-C18（30mm×250mm, 10μm; 填料:十八烷基硅烷键合硅胶）; Agilent 6538Q TOF LC-MS联用仪（Agilent公司）; AB SCIEX 4000 Q TRAPTM三重四级杆/线性离子肼质谱仪（AB公司）; Bruker avance HD 600 MHz核磁共振仪（Bruker公司）, TMS为内标; Nicolet 6700 FT-IR红外光谱仪（尼高力公司）, 溴化钾压片; Virtis advantage 2XL冷冻干燥仪（VIRTIS公司）。
盐酸头孢他美酯原料药（批号070504）, 四川A药业有限责任公司提供, 结构见图 1。甲醇、乙腈为色谱纯, 水为超纯水。
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图 1 头孢他美酯结构图 Fig.1 The structure of cefetamet pivoxil |
色谱柱:Thermo AcclaimTM 120 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）; 流动相:10 mmol·L-1醋酸铵-甲醇-乙腈（327:133:504）; 流速:0.8 mL·min-1; 进样量:10 μL。
2.1.2 色谱条件（分离制备）色谱柱:Agilent Prep-C18（30 mm×250 mm, 10 μm）; 流动相:乙腈-甲醇-水（504:133:327）; 流速:25 mL·min-1; 进样量:1 mL。分离液浓缩除去流动相, 然后冷冻干燥。杂质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的纯度分别为99.6%、92.4%和98.9%。
2.1.3 质谱条件采用电喷雾离子源（ESI）, 正离子模式。Agilent 6538Q TOF LC-MS联用仪质谱参数:毛细管电压3.0 kV, 锥电压35 V, 离子源温度120 ℃, 鞘气温度300 ℃, 锥孔气流速50 L·h-1, 鞘气流速400 L·h-1。AB SCIEX 4000 Q TRAPTM三重四极杆/线性离子肼质谱仪质谱参数:雾化气压力276 kPa, 干燥气压力276 kPa, 气帘气压力69 kPa, 干燥气温度550 ℃, 喷雾毛细管压力5 kV, DP 70 V, EP 10 V, CE 35 V。
2.1.4 核磁共振一维13C-NMR波谱在装配5 mm BBO探头的Bruker avance HD 600 MHz核磁共振仪上采集, 采样时间1.1 s, 弛豫时间1 s, 测量温度25 ℃, 谱宽200, 采样点数64 k, 扫描次数32 769次, 线展宽因子0.3 Hz。
一维1H-NMR波谱在装配5 mm BBO探头的Bruker avance HD 600 MHz核磁共振仪上采集。采样时间4.4 s, 弛豫时间2 s, 测量温度25 ℃, 谱宽13, 采样点数64 k, 扫描次数128次, 线展宽因子0.3 Hz。
二维COS Y-NMR波谱在装配5 mm BBO探头的Bruker avance HD 600 MHz核磁共振仪上采集。采样时间0.2 s, 弛豫时间1.5 s, 测量温度25 ℃, 谱宽13, 采样点数64 k, 扫描次数16次。
二维HSQC-NMR波谱在装配5 mm BBO探头的Bruker avance HD 600 MHz核磁共振仪上采集。采样时间0.2 s, 弛豫时间1.4 s, 测量温度25 ℃, 谱宽δH 13, δC 200, 采样点数64 k, 扫描次数16次。
二维HMBC-NMR波谱在装配5 mm BBO探头的Bruker avance HD 600 MHz核磁共振仪上采集。采样时间0.2 s, 弛豫时间1.4 s, 测量温度25 ℃, 谱宽δH 13, δC 200, 采样点数64 k, 扫描次数16次。
2.2 供试品溶液制备 2.2.1 液相色谱-质谱分析用供试品溶液制备取盐酸头孢他美酯原料药适量, 加“2.1.1”项下流动相溶解并稀释制成每1 mL约含5.0 mg的溶液, 进行液相色谱-质谱分析。
2.2.2 液相制备色谱用供试品溶液制备取盐酸头孢他美酯原料药适量, 加“2.1.2”项下流动相溶解并稀释制成每1 mL约含30 mg的溶液, 进行制备色谱分离。
2.3 结果分析利用“2.1.1”项下色谱条件检测盐酸头孢他美酯原料药中杂质, 记录HPLC-UV色谱图, 见图 2。
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1.头孢他美酯（cefetamet pivoxil）2.杂质Ⅰ（impurity Ⅰ）3.杂质Ⅱ（impurity Ⅱ）4.杂质Ⅲ（impurity Ⅲ） 图 2 盐酸头孢他美酯原料药高效液相色谱图 Fig.2 Chromatogram of cefetamet pivoxil hydrochloride drug substance |
ESI质谱图中显示正离子模式下杂质Ⅰ的分子离子峰为m/z 596.2[M+H]+, 说明其相对分子质量为595。Q TOF高分辨质谱显示, 杂质Ⅰ的分子式为C25H34N5O8S2。
1H-NMR谱显示在高位移δH 12.14和δH 9.68处有2个峰, 为分子中的2个仲胺基, 由于共轭结构影响, NH-10'化学位移较高, 所以δH 12.14为NH-10'峰, δH 9.68为NH-9'峰; C-13~15和C-13'~15'环境相似, 均为甲基峰, 所以在1H-NMR谱的化学位移最低处, 共显示6个甲基的18个H; C-8'为甲基峰, 与杂原子O相连, 在δH 3.88处显示1个3个H的单峰; C-7'上的H为烯氢, 在δH 7.35处显示1个H的峰; H-6和H-7分别在δH 5.16和δH 5.40处显示1个H的峰; H-10在δH 5.8附近显示2个H的峰。
13C-NMR谱显示杂质Ⅰ共含有25个碳; 化学位移较高处为羰基峰, 中间为烯碳峰, 较低处为脂肪族烷基碳峰; 由于给电子基团的影响, 最高处δC 177.69为C-11峰, δC 176.51为C-11'峰; 由于吸电子的影响, 最低处δC 19.92为C-16峰; δC 26.9为C-13~15、C-13'~15'的6个碳原子峰。
DEPT（135°）谱上共出现13个峰, 其中11个为正峰, 2个为负峰, 说明杂质Ⅰ分子中含有11个伯碳和叔碳、2个仲碳和12个DEPT谱中未出现的季碳; 由于烯碳化学位移较高, 所以认定DEPT谱上正峰中的δC 115.3为C-7'峰; DEPT谱上2个负峰为仲碳, 分子中C-10和C-4为仲碳, 由于C-10处于富电子环境中, 所以C-10较C-4化学位移较高, 则δC 79.9为C-10峰, δC 29.8为C-4峰。
1H-1H COSY显示H-6和H-7相关。
HSQC谱显示C-4/H-4、C-7/H-7、C-10/H-10、C-16/H-16、C-8'/H-8'、C-13、14、15、13'、14'、15'/H-13、14、15、13'、14'、15'相关, 根据已知的δC或者δH, 对相关峰进行归属并确认。
HMBC谱可以根据C-H远程相关情况对峰进行归属、验证和确认。1H-NMR和13C-NMR、2D-NMR归属见表 1。
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表 1 杂质Ⅰ1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR数据归属 Tab.1 The data and assignments of 1H-NMR, 13C-NMR and 2D-NMR data for impurity Ⅰ |
IR γmax（KBr cm-1）:3 447.3（N-H伸缩振动）, 3 197.8（CH=C-伸缩振动）, 1 790.8（β-内酰胺C=O伸缩振动）, 1 749.3（C=O伸缩振动）, 1 647.8（酰胺C=O伸缩振动）, 1 541.3（N-H弯曲振动）, 1 398.3（C-H弯曲振动）。
基于以上数据, 杂质Ⅰ鉴定为新戊酰头孢他美酯, 结构见图 3-A。
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图 3 杂质Ⅰ（A）、杂质Ⅱ（B）、杂质Ⅲ（C）化学结构图 Fig.3 Chemical structures of impurityⅠ(A), impurityⅡ(B), impurity Ⅲ(C) |
ESI质谱图中显示正离子模式下杂质Ⅱ的分子离子峰为m/z 1 035.2[M+H]+, 说明其相对分子质量为1 034。Q-TOF高分辨质谱显示杂质Ⅱ的分子式为C41H50N10O14S4。
1H-NMR谱高化学位移处为杂质Ⅱ分子中4个仲胺基的峰, 由于β-内酰胺环吸电子的影响, 使得NH-9″, 9″'化学位移较NH-10″, 10″'高, 所以δH 9.40-9.61为NH-9″, 9″'峰, δH 8.17-8.19为NH-10″, 10″'峰; C-13~15和C-13'~15'环境一样, 均为甲基峰, 所以在1H-NMR谱的化学位移最低处, 共显示6个甲基的18个H; C-8″、C-8″'为甲基峰, 与杂原子O相连, 在δH 3.86处显示1个6个H的单峰; C-7″、C-7″'上的H为烯氢, 在δH 7.02处显示2个氢; H-6、6'和H-7、7'分别在δH 5.1和δH 5.7附近显示2个H的峰; H-10、10'在δH 5.8附近显示4个氢的峰。从1H-NMR谱可以看出, 杂质Ⅱ结构高度对称。
13C-NMR谱显示杂质Ⅱ共含有41个碳; 化学位移较高处为羰基峰, 中间为烯碳峰, 较低处为脂肪族烷基碳峰; 由于给电子基团的影响, 最高处δC 176.51为C-11、11'峰; 由于吸电子影响, 最低处δC 19.91为C-16、16'峰; δC 26.98为C-13~15、C-13'~15'的6个碳原子峰。从13C-NMR谱可看出, 杂质Ⅱ结构高度对称。
DEPT（135°）谱上共出现21个峰, 其中16个峰为正峰, 5个为负峰, 以上信息说明杂质Ⅱ分子中含有16个伯碳和叔碳、5个仲碳和20个DEPT谱中未出现的季碳; 由于烯碳化学位移较高, 所以认定DEPT谱上正峰中的δC 110.0为C-7″、7″'峰; DEPT谱上5个负峰为仲碳, 分子中C-10、10'、C-4、4'和C-11″为仲碳, 由于C-10、10'、C-11″相比C-4、4'处于电子富集环境, 所以δC 79.8为C-10、10'峰, δC 41.66为C-4、4'峰, δC 79.9为C-10峰, δC 29.8为C-4、4'峰。从DEPT谱可以看出杂质Ⅱ结构高度对称。
1H-1H COSY显示H-6和H-7相关, H-6'和H-7'相关, H-11″和H-10″、H-10″'相关。
HSQC谱显示C-4/H-4, C-4'/H-4', C-6/H-6, C-6'/H-6', C-7/H-7, C-7'/H-7', C-10/H-10, C-10'/H-10', C-16/H-16, C-16'/H-16', C-8″/H-8″, C-8″'/H-8″', C-11″/H-11″, C-13、14、15、13'、14'、15'/H-13、14、15、13'、14'、15'相关, 可根据已知的δC或者δH, 对相关峰进行归属并确认。
HMBC谱可以根据C-H远程相关情况对峰进行归属、验证和确认。1H-NMR和13C-NMR、2D-NMR归属见表 2。
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表 2 杂质Ⅱ1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR数据归属 Tab.2 The data and assignments of 1H-NMR, 13C-NMR and 2D-NMR data for impurity Ⅱ |
IR γmax（KBr cm-1）:3 435.3（N-H伸缩振动）, 3 186.6（CH=C-伸缩振动）, 1 782.4（β-内酰胺C=O伸缩振动）, 1 676.0（酰胺C=O伸缩振动）, 1 541.3（N-H弯曲振动）, 1 399.1（C-H弯曲振动）。
基于以上数据, 杂质Ⅱ结构高度对称, 鉴定为头孢他美酯二聚体, 结构见图 3-B。
2.3.3 杂质Ⅲ结构确证ESI质谱图中显示正离子模式下杂质Ⅲ的分子离子峰为m/z 282.1[M+H]+, 说明其相对分子质量为281。Q-TOF高分辨质谱显示杂质Ⅲ的分子式为C13H15NO2S2。
1H-NMR谱显示分子中含有ABMN系统芳香环（H-1, 4, δH 7.91-8.07和H-2, 3, δH 7.40-7.53）; 化学位移最低处δH 1.15为C-14~16 3个甲基的9个H峰; δH 5.86处显示C-13的2个氢。
13C-NMR谱显示杂质Ⅲ共含有13个碳; 化学位移较高处为羰基峰, 中间为烯碳峰, 较低处为脂肪族烷基碳峰; 化学位移最高处δC 177.3为C-11峰, 最低处δC 27.0为C-14~16峰; 由于杂原子给电子影响, δC 65.78为C-13峰; 由于杂原子给电子影响, 烯碳C-8、6、5位移从高到低分别为δC 164.5、δC 152.9和δC 135.5;芳香环4个烯碳峰均在δC125附近。
DEPT（135°）谱上共出现8个峰, 其中7个峰为正峰, 1个为负峰, 以上信息说明杂质Ⅲ分子中含有8个伯碳和叔碳、1个仲碳和4个DEPT谱中未出现的季碳; 由于烯碳化学位移较高, 所以认定DEPT谱上正峰中的δC 125附近为C-1~4峰; DEPT谱上1个负峰为仲碳, 分子中C-13为仲碳, 所以δC 65.8为C-13峰。
1H-1H COSY显示H-1和H-2、H-3、H-4相关。
HSQC谱显示C-1/H-1, C-2/H-2, C-3/H-3, C-4/H-4, C-12/H-12, C-14、15、16/H-14、15、16相关, 可根据已知的δC或者δH, 对相关峰进行归属并确认。
HMBC谱可以根据C-H远程相关情况对峰进行归属、验证和确认。1H-NMR和13C-NMR、2D-NMR归属见表 3。
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表 3 杂质Ⅲ1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR数据归属 Tab.3 The data and assignments of 1H-NMR, 13C-NMR and 2D-NMR data for impurity Ⅲ |
1H-NMR和13C-NMR、2D-NMR归属见表 3。IR γmax（KBr cm-1）:3 151.6（CH=C-伸缩振动）, 1 739.3（C=O伸缩振动）, 1 400.2（C-H弯曲振动）。
基于以上数据, 杂质Ⅲ鉴定为8-（1-硫-2-羰基-3-甲氧基-1-异丁烷）-苯并噻唑, 为盐酸头孢他美酯合成副产物, 结构见图 3-C。
3 结论本文采用液相制备色谱, 从盐酸头孢他美酯原料药中分离制备出3个有关物质, 并采用质谱和光谱技术, 包括1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、IR技术对其进行结构确证, 确证3个杂质分别为新戊酰头孢他美酯（杂质Ⅰ）、头孢他美酯二聚物（杂质Ⅱ）和8-（1-硫-2-羰基-3-甲氧基-1-异丁烷）-苯并噻唑（杂质Ⅲ）。结果表明, 杂质类型主要为头孢他美酯聚合和头孢他美酯合成副产物。本研究对进一步控制盐酸头孢他美酯原料药质量, 研究不良反应的产生原因, 减少不良反应具有实际指导意义。
| [1] |
马伟杭, 陈亚岗, 郑经川, 等. 盐酸头孢他美酯治疗细菌感染性疾病的多中心临床研究[J]. 中国抗生素杂志, 2001, 26(2): 139. MA WH, CHEN YG, ZHENG JC, et al. A multiple center randomized controlled clinical study of cefetamet pivoxil hydrochloride in the treatment of bacterial infectious diseases[J]. Chin J Antibiot, 2001, 26(2): 139. DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2001.02.016 |
| [2] |
李丹凤, 颜其双, 邓鸣, 等. 盐酸头孢他美酯分散片有关物质的色谱-质谱结构鉴[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(3): 451. LI DF, YAN QS, DENG M, et al. Separation and identification of related substances in cefetamet pivoxil hydrochloride dispersible tablets by LC-MS method[J]. Chin J Pharm Anal, 2017, 37(3): 451. |
| [3] |
俞绍鑫, 吴朝倩. 盐酸头孢他美酯的药理与临床应用[J]. 中国抗生素杂志, 2001, 26(2): 153. YU SX, WU CQ. Pharmacology and clinical application of cefetamet pivoxil hydrochloride[J]. Chin J Antibiot, 2001, 26(2): 153. DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2001.02.019 |
| [4] |
刘家健, 刘敦茀, 曾晓辉, 等. 国产盐酸头孢他美酯的制备[J]. 中国抗生素杂志, 2001, 26(2): 151. LIU JJ, LIU DF, ZENG XH, et al. The process development of domestic cefetamet pivoxil hydrochloride[J]. Chin J Antibiot, 2001, 26(2): 151. DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2001.02.018 |
| [5] |
夏鸣, 杭太俊, 李小敏, 等. β-内酰胺类抗生素中高分子聚合物杂质检查方法的研究综述[J]. 药学进展, 2007, 31(11): 501. XIA M, HANG TJ, LI XM, et al. A review on the test methods for high-molecular weight polymer impurities in β-lactam antibiotics[J]. Prog Pharm Sci, 2007, 31(11): 501. DOI:10.3969/j.issn.1001-5094.2007.11.005 |
| [6] |
赵静, 王晶, 陈海怡, 等. β内酰胺类抗生素的皮肤过敏试验现状及建议[J]. 中国临床药理学杂志, 2009, 25(2): 158. ZHAO J, WANG J, CHEN HY, et al. Current situation and suggestion about skin sensitivity test of β-lactam antibiotics[J]. Chin J Clin Pharmacol, 2009, 25(2): 158. DOI:10.3969/j.issn.1001-6821.2009.02.017 |
| [7] |
贾可, 夏永恒, 张治云, 等. HPLC测定盐酸头孢他美酯颗粒的有关物质[J]. 食品与药品, 2014, 16(4): 270. JIA K, XIA YH, ZHANG ZY, et al. Determination of related substances in cefetamet pivoxil hydrochloride granules by HPLC[J]. Food Drug, 2014, 16(4): 270. DOI:10.3969/j.issn.1672-979X.2014.04.016 |
| [8] |
王建, 王丹丹, 洪利娅, 等. HPLC法测定盐酸头孢他美酯中的有关物质和聚合物[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(2): 295. WANG J, WANG DD, HONG LY, et al. HPLC simultaneous determination of related substances and polymers in cefetamet pivoxil hydrochloride[J]. Chin J Pharm Anal, 2015, 35(2): 295. |
| [9] |
李丹凤, 黄丽丽, 刘庄蔚, 等. 盐酸头孢他美酯及其制剂中有关物质的HPLC法测定[J]. 中国医药工业杂志, 2016, 47(7): 918. LI DF, HUANG LL, LIU ZW, et al. Determination of the related substances in cefetamet pivoxil hydrochloride and its preparations by HPLC[J]. Chin J Pharm, 2016, 47(7): 918. |
| [10] |
任凤英, 黎鹏, 李直, 等. RP-HPLC法测定盐酸头孢他美钠含量和有关物质[J]. 中国抗生素杂志, 2012, 37(12): 916. REN FY, LI P, LI Z, et al. Determination of cefetamet sodium and its related substances by HPLC[J]. Chin J Antibiot, 2012, 37(12): 916. DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2012.12.006 |
| [11] |
WANG DD, WANG F, WANG J. Characterization of the impurities and isomers in cefetamet pivoxil hydrochloride by liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry and ion trap mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed Anal, 2015, 111: 71. DOI:10.1016/j.jpba.2015.03.013 |
| [12] |
ICH Guideline Q3A (R) Impurities in New Drug Substances. Step 4[S]. 2002
|