仁青常觉是藏族验方，始载于藏医现存最早的典籍《四部医典》，现收载于2015年版《中华人民共和国药典》一部^[1]。仁青常觉系藏医珍宝药之极品，是由珍珠、朱砂、檀香、降香、诃子、牛黄、麝香、西红花等160多种药味加工制成的丸剂^[2]，具有清热解毒、调和滋补之功效，在临床应用极为广泛，尤其对慢性胃肠炎、胃溃疡、萎缩性胃炎^[3]等胃肠病晚期疗效显著。迄今为止，有关藏药仁青常觉的参考资料大多来源于藏医的历代传承或藏医院的临床经验总结，有关仁青常觉的毒性研究仅有零星文献报道^[4-6]，由于仁青常觉的治疗功用是“佐太”与众多药物共同作用的结果，因此仅从药物无机元素总量的角度对其安全性进行评价具有一定的局限性。尿液样本作为砷（As）的生物暴露标志物，被广泛地接受。尿砷具有更长的半衰期，人类和动物通过各种途径摄入的As大部分以代谢的和未代谢的形式通过尿液排出体外^[7]。尿液样本的采集简单易行，而且尿液的基质更简单，分析前基本不需要处理。

目前，As形态分析大多采用高效液相色谱（HPLC）和电感耦合等离子体质谱联用（ICP-MS）技术^[8-12]。本文采用ICP-MS技术，通过与对照组的比较分析，对给药组不同剂量的大鼠尿液样本中的As总量进行了考察，研究了连续给药15 d与停药恢复15 d后As在大鼠体内代谢的情况。通过HPLC-ICP-MS技术，对给药组大鼠尿液样本中的As进行形态分析，考察了仁青常觉在体内的代谢情况以及可能的毒副作用，以期为仁青常觉的安全性评价提供新的理论基础。

1 材料及方法 1.1 实验仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪，四元梯度泵。CENRIFUGE 5810R离心机（Eppendorf公司），超纯水系统（PALL，USA）。Agilent 7500ce电感耦合等离子体质谱仪。

1.2 药品与试剂

标准储备液：①As形态和总As溶液标准物质（中国计量科学研究院）：三价砷[As（Ⅲ）]（GBW08666）、五价砷[As（V）]（GBW08667）、一甲基胂（MMA）（GBW08668）、二甲基胂（DMA）（GBW08669）、甜菜碱AsB（GBW08670）和As（GBW08611），浓度分别为（75.7±1.2）μg·g^-1、（17.5±0.4）μg·g^-1、（25.1±0.8）μg·g^-1、（52.9±1.8）μg·g^-1、（38.8±1.1）μg·g^-1和1 000 mg·L^-1，均购于国家标准物质中心；②锗标准储备液：1 000 mg·L^-1（国家钢铁研究总院）。硝酸：优级纯（Merck公司）；双氧水：MOS级；磷酸二氢钠、无水乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、氢氧化钠、无水乙醇，优级纯；调谐溶液：10 μg·L^-1锂、钴、钇、铈、铊混合标准溶液（2%硝酸介质，Agilent，Part#5184-3566）；超纯水（18.2 MΩ），由超纯水系统制得，用于配制所有标准溶液与样品溶液；仁青常觉（青海某藏医院提供）；水相滤膜：0.22 μm。

1.3 动物实验分组、给药和取样方案

48只正常雄性SD大鼠，动物使用许可证编号SCXK2011-0004。正式开始实验前，所有大鼠适应性喂养1周，保持环境温度为（25±2）℃、湿度为（55±5）%。1周后，称量所有大鼠的体质量（260±10）g，随机分为4组（n=12），分别为低剂量组、中剂量组、高剂量组和正常对照组。仁青常觉悬浮于去离子水中，分别按照250.0、666.7和1 666.7（mg·kg^-1·d^-1）的剂量给药，正常对照组的剂量为与给药组大致相当体积的0.9%盐水溶液。给药剂量相当于正常临床剂量的15、40和100倍。

连续灌胃给药15 d，并且每5 d对大鼠称量，记录体质量，依据体质量变化调整药量，每天收集尿液样本。连续给药15 d后每组随机抽取一半大鼠处死，剩余大鼠停药观察15 d后处死。在此期间，每日观察大鼠的外观特征，包括毛色，眼、鼻处的分泌物，行为表现以及进食和排泄等情况。

1.4 供试品溶液的配制 1.4.1 As总量的供试品溶液

临用前将冷冻大鼠尿液样本取出，恢复到室温，摇匀后取1.0 mL尿液于50 mL PET塑料瓶中，加入浓硝酸2 mL和双氧水1 mL，用超纯水定量至30.00 g，混合均匀，随同样品进行空白试验。

1.4.2 As形态的供试品溶液

临用前将冷冻大鼠尿液样本取出，恢复到室温，3 000 r·min^-1离心（离心半径为6.8 cm）15 min。取离心后尿样0.2 mL，用超纯水稀释5倍，然后过0.22 μm纤维素滤膜，即得。

1.5 标准溶液的配制 1.5.1 As总量的标准溶液

精密称取1 000 mg·L^-1的总As标准物质0.100 0 g，置50 mL PET瓶中，用5%的硝酸溶解并定量至10.00 g，即得质量浓度为10 mg·L^-1的As标准储备液。用5%硝酸介质将质量浓度为10 mg·L^-1的As标准储备液逐级稀释为0.500 0、2.00、5.00、10.00，100.00 μg·L^-1的系列标准溶液。

1.5.2 锗内标溶液

精密称取1 000 mg·L^-1的锗标准物质0.100 0 g，置100 mL PET瓶中，用5%的硝酸溶解并定量至100.00 g，即得质量浓度为1 mg·L^-1的锗内标溶液。

1.5.3 As形态的混合标准溶液

分别精密称取AsB、As（Ⅲ）、As（V）、MMA和DMA的标准物质0.066 1、0.285 7、0.199 2、0.094 5、0.128 9 g，置50 mL PET瓶中，用水溶解并定量至5.000 g，即得质量浓度均为1 mg·L^-1（以As计）的混合标准储备液。分别用超纯水将1 mg·L^-1的AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）的混合标准储备液逐级稀释，配制成浓度为0.5、2.0、5.0、10.0和100.0 μg·L^-1的系列混合标准溶液。

1.6 色谱条件

色谱柱：Ion Pac AS 19阴离子分析柱（250 mm×4 mm，7.5 μm）及配套的保护柱Ion Pac AG 19（50 mm×4 mm，11 μm）；流动相：A相（2 mmol·L^-1磷酸二氢钠-0.2 mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠-10 mmol·L^-1无水乙酸钠-3 mmol·L^-1硝酸钾，pH=10.5~11.3），B相（无水乙醇），A-B（99:1）混合等度洗脱；流速：1.0 mL·min^-1；进样量：10 μL。

1.7 ICP-MS工作条件

功率：1 550 W；雾化器：玻璃同心雾化器；柱后在线加入内标，提升速率：0.3 r·s^-1；载气流量：0.7 L·min^-1；辅助气流量：0.32 L·min^-1；采样深度：9.5 mm；采集质量数：⁷⁵As、³⁵Cl、⁷²Ge。

2 结果与讨论 2.1 As形态的分离与检测

目前As形态分离多采用离子交换机理，根据As化合物的离子特性，阴离子交换色谱通常用来分析As（Ⅲ）、As（V）、MMA和DMA，而阳离子交换色谱用于分离AsB、AsC、TMAO和TET-RA。不同形态的As之所以能够被离子交换分离，其主要原因在于多数As的化合物在选定的分离条件下以离子型化合物的形式存在。目前As形态分析常采用Hamilton PRP-X100色谱分离柱进行无机As形态的分离，Dionex Ion Pac AS柱多应用于无机As与有机As的形态分离。考虑到给药大鼠尿液中可能同时含有无机As与有机As等多种形态，本实验参照文献[13]，采用Dionex Ion Pac AS19阴离子色谱柱，以2 mmol·L^-1磷酸二氢钠-0.2 mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠-10 mmol·L^-1无水乙酸钠-3 mmol·L^-1硝酸钾（pH=10.5~11.3）-无水乙醇为流动相，等度洗脱，流速1.0 mL·min^-1，进样量10 μL，柱温为室温。色谱分离图如图 1所示。该方法与文献[ 11，14]相比，优点在于分析时间较短，流速较低，在11 min内就能完成色谱分离，且峰形良好；缺点在于流动相中的盐分稍高，大批量样品测定时会影响As测定时的灵敏度，特别是采用HPLC-ICP-MS时，盐在锥孔处易富集，影响测定结果。

2.2 干扰及消除

在分析测试前，先用调谐液优化仪器条件，使⁷⁵As有较高的灵敏度和较低的检测下限。样本中存在的其他离子会影响流动相的离子强度，从而也会影响As形态在色谱柱里的分离；且³⁵Cl和仪器所用的高纯载气⁴⁰Ar易形成⁷⁵ClAr⁺，即⁴⁰Ar³⁵Cl⁺，干扰⁷⁵As，因此，在As总量测定中，使用仪器自带的干扰方程来校正该多原子离子干扰。在形态分析中，采用时间分辨分析模式，仪器同时监测⁷⁵As、³⁵Cl的信号，用以排除⁷⁵ClAr⁺干扰峰^{[6, 15]}。

2.3 As形态的稳定性及保存条件

As的各种形态之间会转化。通常情况下，As（Ⅲ）、As（Ⅴ）在实际样本中同时存在，且极易相互转化，氧化环境下主要以As（Ⅴ）为主，还原环境下则以As（Ⅲ）为主。温度和As化合物的浓度对As（Ⅲ）、As（Ⅴ）的稳定性有显著影响，刘葳等^[16]通过研究As形态标准溶液在不同保存条件下的形态稳定性问题，确定无机As形态标准溶液的最佳保存条件为避光冷藏4 ℃条件下保存5 d。在本文实验条件下，样品提取完立即在冰箱避光冷藏保存，且检测时间不超过24 h，As（Ⅲ）和As（Ⅴ）不会相互转化，而且As形态的标准溶液现用现配，这些措施保证了本实验的As形态之间不会相互转化。

2.4 线性关系考察及检测下限

精密吸取“1.5.3”项下系列质量浓度的AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）混合标准溶液10.0 μL，按仪器工作条件进行测定，以峰面积对各As形态化合物的质量浓度进行线性回归，分别得AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）的回归方程：

$ \begin{array}{l} Y = 6.0 \times {10^3}X + 6.5 \times {10^3}{\rm{ }}\\ Y = 2.5 \times {10^3}X + 7.8 \times {10^3}{\rm{ }}\\ Y = 2.3 \times {10^3}X + 8.6 \times {10^3}{\rm{ }}\\ Y = 3.9 \times {10^3}X + 3.1 \times {10^3}\\ Y = 8.3 \times {10^3}X + 5.3 \times {10^3} \end{array} $

相关系数均在0.999以上。AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）的质量浓度均在0.5~100.0 μg·L^-1范围内线性关系良好。取混合标准溶液，加超纯水逐级稀释。进样测定，求得AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）的检测下限（S/N=3）分别为0.02、0.1、0.04、0.04、0.06 μg·L^-1。

2.5 回收率试验

将空白大鼠尿液样本从冰箱冷冻层取出，恢复到室温，等分9份，3 000 r·min^-1离心（离心半径为6.8 cm）15 min。分别加入“1.5.3”项下混合标准溶液适量，配制成低、中、高质量浓度的标准尿液样本，每个浓度3份，涡旋1 min混合均匀，按“1.4.2”项余后步骤处理样本并测定，计算加样回收率，结果显示，尿液样本中AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）的平均回收率（n=9）分别为92.8%、85.3%、95.0%、89.3%、96.8%，RSD分别为1.8%、2.8%、1.5%、2.2%、1.8%，符合测定要求。

2.6 精密度试验

精密吸取低、中、高质量浓度（0.5、10、100 μg·L^-1）的AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）的混合标准溶液10.0 μL，分别于同1 d内连续进样6次，测定5种As的峰面积，计算日内RSD；连续5 d（考虑到As形态标准溶液的稳定性，此处选5 d）每天进样1次，测定5种As的峰面积，计算日间RSD。结果AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）低质量浓度的日内和日间精密度分别为0.91%、0.30%、1.5%、0.80%、1.5%和1.4%、0.57%、1.8%、1.1%、1.7%，中质量浓度的日内及日间精密度分别为0.8%、0.20%、1.3%、1.1%、1.2%和1.1%、0.37%、1.2%、0.90%、1.1%，高质量浓度的日内及日间精密度分别为0.60%、0.20%、1.0%、0.80%、1.1%和0.50%、0.30%、1.2%、0.48%、0.12%，表明其精密度良好。

2.7 定量下限

精密吸取“1.5.3”项下混合标准溶液，逐级稀释，分别进样10.0 μL，信噪比S/N=10时测得的AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）定量下限分别为0.07、0.34、0.135、0.13、0.2 μg·L^-1。

取AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）的定量下限浓度溶液，分别于同1 d内连续进样6次，进行日内精密度试验；另连续5 d（考虑到砷形态标准溶液的稳定性，此处选5 d），每天进样1次，进行日间精密度试验。结果表明，AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）的日内和日间精密度分别为1.8%、1.4%、2.0%、1.3%、1.6%和1.7%、1.5%、2.5%、1.8%、2.0%，表明其精密度良好。

于AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）的定量下限浓度溶液中分别加入不同质量浓度的混合对照品溶液，每个浓度3份，按加样回收率测定法测定，结果见表 1。结果显示，AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA及As（Ⅴ）定量下限的平均回收率均大于90.0%，符合测定要求。

2.8 大鼠行为与体质量情况

正常对照组和中、低2个剂量组的大鼠在连续给药和停药恢复期间未发现死亡。连续给药3 d后，高剂量组有1只大鼠出现呆顿、倦怠、毛色干枯等现象；连续给药5 d后，该只大鼠死亡，连续给药10 d后，高剂量组的大鼠中又有1只出现倦怠、毛色干枯并伴随进食量减少等现象；给药15 d后，该大鼠发育状况明显低于正常对照组，停药后，可观察到恢复迹象。其他大鼠在给药与停药恢复期间均发育良好，大小便正常，眼、鼻处未见异常分泌物，毛发、饮食、行为活动等与正常对照组无明显差异。

正常对照组中除1只大鼠体质量增长迅速外，其余各组大鼠体质量随天数的增加而逐渐增长，各给药组大鼠体质量的平均值与对照组不存在显著性差异，详见表 2。连续给药15 d后，高剂量组中有1只大鼠体重增长缓慢，虽然停药后有恢复趋势，但其体质量仍低于同组其他大鼠。由此可见，仁青常觉对大鼠体质量总体上影响不大，但高剂量（按正常临床剂量的100倍）连续服用后，可能会对一些体质相对较差的个体造成较大伤害，使其出现行为异常、增长迟缓、死亡等现象，由此揭示，仁青常觉只有在服用远超出正常临床剂量时，才具有一定的毒性。

2.9 仁青常觉中As在大鼠尿液中的总量分析

由于每天实际收取的大鼠尿液样本存在较少、没有或死亡等情况，本论文只选取尿液样本较多且具有代表性的样本即第0、3、6、9、12、15、18、23、26、30天的样本，测定结果见表 3。由图 2显示，总体上，给药期间低、中、高剂量组的大鼠尿液中As总量均高于正常组，随着给药的连续进行，As随尿液的排出量明显增加，第15天时，高剂量组的大鼠尿液中As的排出量达到最大值，但组内的差异性也随之增大；停药后，低、中、高剂量组尿液中的As浓度明显降低，见表 3。

尿液中As浓度随给药天数显著增加表明尿液是体内As排泄的一个重要途径。虽然As的尿排泄量很大，但停药3 d后，低、中、高剂量组大鼠尿液中的As浓度均明显降低。停药后的第3天即整个喂养的第18天，As浓度明显降低；停药后第11天与第15天（即整个喂养的第26天与第30天），As浓度差异不大，但并没有恢复到正常对照组的水平，可能与给药剂量大，停药后观察时间较短等因素有关，具体原因还需要进一步研究。

2.10 仁青常觉中As在大鼠尿液中的形态分析

仁青常觉中As在大鼠尿液中的总浓度分析结果显示：低、中，高剂量组的大鼠尿液中As浓度在给药第15天达到最高值，在第18天（即停药第3天）浓度明显降低，在第26天和第30天（即停药第11天与第15天）的浓度差异不大。故大鼠尿液中As形态分析选择代表性的第15天和第26天的低、中、高剂量组的尿液样本，采用优化好的条件对大鼠尿液进行As形态分析，结果见表 4和图 3。

As在尿液样本中的形态分布和浓度，不仅可作为As暴露的生物标志物，而且还可以帮助人们理解As在人和动物体内的生物代谢过程。自然界中可检出的As化物化学形态有几十种，其中以无机化学形态的As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的毒性最强，而MMA和DMA的毒性相对较弱。本实验发现，给药15d后大鼠尿液中主要As形态化合物为AsB、DMA、As（Ⅲ）和As（Ⅴ），详见图 3-A~C。第26天即停药后第11天大鼠尿液中主要As形态化合物为AsB、DMA和As（Ⅴ），详见图 3-D~F，表明随着停药时间的延长，仁青常觉中As（Ⅲ）经大鼠体内代谢后被部分氧化为As（Ⅴ）和其他形态的As。仁青常觉中As在大鼠体内的代谢研究表明，As（Ⅲ）通过吸收进入体内，后被部分氧化为As（Ⅴ），经过生物甲基化反应，转化为DMA，最终通过尿液排出体外^[10]。由表 3及表 4的总As和4种形态的As在尿液中的浓度变化趋势，发现As（Ⅲ）、As（Ⅴ）在尿液中的排泄速度和总As类似，DMA排泄最快^[17]。

3 结论

利用HPLC-ICP-MS联用技术，通过优化测定条件，对藏药仁青常觉中As在大鼠体内代谢产物—尿液中的形态进行研究。结果显示，尿液中As总浓度随给药天数的加长显著增加；尿液中的As总浓度随着停药时间的加长明显降低，但并没有恢复到正常对照组的水平，这可能与停药后观察时间较短有关，具体原因还需要进一步研究。尿液中As形态的分析表明，仁青常觉中的As（Ⅲ）通过大鼠给药吸收进入体内，后在大鼠体内被部分氧化为As（Ⅴ），经过生物甲基化反应，转化为DMA，最终通过尿液排出体外。4种As形态在大鼠尿液中的排泄速度以DMA最快。

仁青常觉中As在大鼠体内代谢产物—尿液中的形态分析，为藏药中As的形态和毒理学研究提供了依据。