含量测定类方法验证中的统计学评价

方法验证专栏

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马莉, 杨亚宗, 张云雷, 冯铮铮, 谭德讲, 吕昭云, 杭太俊. 含量测定类方法验证中的统计学评价[J]. 药物分析杂志, 2019, 39(2): 207-214. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.02.04.

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MA Li, YANG Ya-zong, ZHANG Yun-lei, FENG Zheng-zheng, TAN De-jiang, LÜ Zhao-yun, HANG Tai-jun. Statistical evaluation of method validation for content determination[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2019, 39(2): 207-214. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2019.02.04.

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基金项目

国家十二五“重大新药创制”科技重大专项（2015ZX09303001）

第一作者

马莉, Tel:15311951812;E-mail:15311951812@163.com;
杨亚宗, Tel:18001327269;E-mail:yangyazong123@126.com。

通信作者

冯铮铮, Tel:13683611439;Email:13683611439@163.com
谭德讲, Tel:(010)53851581;E-mail:tandj@nifdc.org.cn

文章历史

收稿日期：2018-12-14

Contents Abstract Full text Figures/Tables PDF

含量测定类方法验证中的统计学评价

马莉 ^1,3, 杨亚宗 ², 张云雷 ², 冯铮铮 ², 谭德讲 ¹, 吕昭云 ², 杭太俊 ³

1. 中国食品药品检定研究院, 北京 102629;
2. 北京协和药厂, 北京 102629;
3. 中国药科大学, 南京 210009

收稿日期：2018-12-14

基金项目：国家十二五“重大新药创制”科技重大专项（2015ZX09303001）

第一作者：马莉, Tel:15311951812;E-mail:15311951812@163.com
杨亚宗, Tel:18001327269;E-mail:yangyazong123@126.com

通信作者：冯铮铮, Tel:13683611439;Email:13683611439@163.com
谭德讲, Tel:(010)53851581;E-mail:tandj@nifdc.org.cn

摘要：目的：针对双环醇片主成分的测定方法，论证含量测定类方法验证的科学性和可靠性，为今后该类方法的验证研究提供更严谨的模板或范例。方法：通过科学的实验设计，制定合理的实验方案，获得专属性、线性与范围、准确度和精密度等性能参数。结果：双环醇片中主成分与有关物质可完全分离。在标示量70%~130%的范围内线性关系良好（决定系数R²>0.999 9，剩余标准偏差RSME=0.299 6）；在80%~120%的5个浓度点下的相对偏倚均不超过0.78%，其95%置信限均不超过±2%；各浓度下的中间精密度均不超过0.89%，中间精密度的置信上限均不超过1.43%；方法的总变异在120%浓度下最大，为0.87%，所对应的95%/90%容忍区间为98.11%~102.78%，95%预测区间为98.95%~101.95%；对可接受标准为90.0%~110.0%的双环醇片，其方法能力指数均超过2，即该方法的误判率低于1/100万。结论：该方法经验证可满足其对双环醇片含量定量测定的预期用途。同时通过实验设计可获得更多科学可靠的方法性能指标，这些指标使得方法验证的结论更加可靠和直观，且能够从整体把握方法的适用性。新提供的方法容忍区间、预测区间和方法能力指数等参数，为今后判断方法确认和转移是否成功提供了依据。

关键词：双环醇方法验证含量测定方法能力指数置信限高效液相色谱

Statistical evaluation of method validation for content determination

MA Li^1,3, YANG Ya-zong², ZHANG Yun-lei², FENG Zheng-zheng², TAN De-jiang¹, LÜ Zhao-yun², HANG Tai-jun³

1. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629, China;
2. Beijing Union Pharmaceutical Factory, Beijing 102629, China;
3. China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China

Abstract: Objective: To demonstrate the scientificity and reliability of the method validation for major content determination in bicyclol tablets as an example in order to provide a more rigorous template or example for future validation of such methods.Methods: Through scientific experiment design and reasonable experimental scheme to obtain performance parameters, such as specificity, linearity and range, accuracy and precision.Results: The main components in bicyclol tablets could be completely separated from the related substances. The linearity was excellent in the range of 70% to 130% of labeling quantity(R²>0.999 9, RSME=0.299 6). All relative biases did not exceed 0.78% at the five concentration points of 80%-120%, and all 95% confidence limits did not exceed ±2%. All intermediate precisions were not more than 0.89% and all upper confidence limits of the intermediate precision were not more than 1.43%. The maximum total variation of the method was 0.87% at the concentration of 120% and the corresponding 90% tolerance interval with 95% confidence level was 98.11%-102.78%.The prediction interval with 95% confidence level was 98.95%-101.95%. For bicyclol tablets with the acceptable criteria of 90.0%-110.0%, the method capability index was more than 2, which means the misjudgment rate of this method was less than one millionth.Conclusion: The method has been validated to meet its intended use for quantitation of bicyclol tablets. More scientific and reliable method performance indicators can be obtained through the design of experiment, which make the conclusions of the method validation more reliable and intuitive, and can grasp the applicability of the method from the whole. The newly provided tolerance interval, prediction interval and the method capability index, etc., provide a basis for judging the success of method verification and transfer in the future.

Keywords: bicyclol method validation content determination method capability index confidence limit HPLC

分析方法是药品质量标准中的要素之一，稳健可靠的分析方法是控制药品质量的重要基础；各国药典和相关法规对方法验证都非常重视，并提出相应的规范要求^[1-3]，重点指导方法验证的规范性。但目前这些法规之间存在差异，对一些基本问题的回答还存在含糊不清之处，如ICH对方法验证的LOD值给出了不同的获取方式，但对于不同方式并未作深入比较，如何更全面规范地描述方法满足其预期用途仍然值得探讨。本文拟通过对双环醇片的含量检测方法^[4]，结合方法验证的最新进展^[5-6]和本专栏中《定量理化分析方法满足预期用途的判断标准探讨》《方法验证性能参数的获取和评价新方式探讨》的论述，从顶层设计出发，在原有方法^[7]的基础上，引入更多统计分析手段，对其方法验证进行深入评价，同时为今后含量测定类方法的验证提供参考依据。

1 仪器和试药 1.1 仪器

2台不同编号的U3000高效液相色谱仪(带DAD检测器，Thermo公司)；XS 2015十万分之一电子天平(Mettler Toledo公司)；Thermo超纯水机(Thermo公司)；KQ2200E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂和试药

对照品：双环醇(批号101044-201001，纯度99.7%)、联苯双酯(批号100192-201504，纯度99.9%)、甲醚化双环醇(批号420032-201501，用于鉴别)，均由中国食品药品检定研究院提供。

样品：双环醇片(批号181104，规格25 mg，北京协和药厂)。

试剂：乙腈(色谱级，批号178496，Fisher Chemical公司)；乙酸(色谱纯，批号20140307，天津福晨化学试剂厂)；自制超纯水、纯化水。

2 溶液的制备 2.1 供试品溶液

取本品10片，用乳钵研细至无颗粒感，取约145 mg(约相当于双环醇25 mg)，精密称定，置25 mL量瓶中，加入乙腈超声(功率100 W，频率40 kHz)溶解，用乙腈稀释至刻度，滤过，精密吸取续滤液5 mL，置50 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL中约含双环醇100 μg的溶液，即得。

2.2 空白辅料溶液

取空白片粉末约120 mg，按“2.1”项下方法配制，即得。

2.3 杂质增敏供试溶液

精密称取双环醇杂质Ⅰ对照品(联苯双酯)20 mg与双环醇杂质Ⅱ对照品(甲醚化双环醇)60 mg，置20 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，即得杂质储备液；精密量取杂质储备液和“2.1”项下的续滤液各5 mL，置50 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，即得。

2.4 双环醇对照品溶液

取双环醇对照品适量，按“2.1”项下方法配制，制成每1 mL中约含双环醇100 μg的溶液，即得。

3 色谱条件

色谱柱：Waters C₁₈ Symmetry(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；流动相：乙腈-水-醋酸(55:45:0.01)；流速：0.5 mL·min^-1；检测波长：228 nm；进样体积：10 μL；分析时间：16 min。

4 统计分析软件

本文所用统计软件包括JMP和《理化方法验证统计软件(PCMV)》

5 方法验证及结果 5.1 系统适用性和专属性

精密量取“2”项下各溶液10 μL，以及空白溶剂10 μL，注入液相色谱仪，获得色谱图(图 1)。双环醇的保留时间大约在8 min，主峰与相邻杂质联苯双酯峰的分离度为13.67 > 2，理论塔板数以双环醇计为131 55，双环醇的回收率为100.6%。空白溶剂、空白片及主要杂质均对双环醇的测定均无干扰。

1.双环醇(bicyclol) 2.联苯双酯(bifendate) 3.甲醚化双环醇(methyl etherified bicyclol) 图 1 空白辅料溶液(A)、供试品溶液(B)、双环醇对照品溶液(C)、空白溶剂(D)、杂质增敏供试溶液(E)的色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of blank excipient solution (A), sample solution (B), bicyclol reference solution (C), blank solvent (D) and impurity sensitized sample solution (E)

5.2 线性 5.2.1 实验设计

对于原料药或制剂的含量测定，USP < 1225 > 及ICH指南均推荐线性的最小范围应包括80%~120%的5个浓度点。在此基础上，期望考察更宽范围的线性关系，因此检测了7个浓度点，即相对于标示量的70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%。

5.2.2 操作步骤

精密称定双环醇对照品7份，按“2.1”项下方法配制，得到质量浓度分别为70、80、90、100、110、120、130 μg·mL^-1的系列对照品溶液，相当于标示量的70%~130%。取上述系列对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图(各溶液平行2次测定)，检测结果见表 1。

表 1 线性试验的原始数据 Tab.1 Raw data for linear test

5.2.3 数据分析

线性方程：在判断各个浓度下的数据均满足方差齐性的前提以后，以双环醇对照品浓度X(mg·mL^-1)为横坐标，色谱峰峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得到的线性曲线如图 2所示。可知曲线的回归方程：

$ Y = 2\;050.868X + 0.134\;\;\;\;{R^2} > 0.999\;9\;\;\;{\rm{RSME}} = 0.299\;6 $

图 2 线性拟合结果 Fig.2 Linear fitting result

截距的检验：将截距与零点做统计学比较^[8]，结果如表 2所示。进行截距与零点的t检验得概率P=0.749 > 0.05，证明截距与零点无显著差异；截距的95%置信区间为[-0.761，1.030]，此区间包括了零点，因此可以使用外标法计算浓度。

表 2 截距的检验结果 Tab.2 Intercept test results

残差分布：所得线性方程的残差分布情况如图 3所示。正态分位数图显示残差分布趋于正态，表明在标示量70%~130%的范围内，残差的分布不会受到浓度变化的影响，所得线性方程在标示量70%~130%的范围内，浓度与峰面积的线性关系良好。

图 3 残差正态分位数图 Fig.3 Residual normal quantile map

5.3 准确度和精密度 5.3.1 实验设计

(1) 实验样本量的计算：合适的实验样本量n^[9]可以确保所获得性能参数的可靠性，同时满足了验证试验的完整性和把握度。根据预实验情况，在JMP软件中输入方法的偏倚θ值(不超过5%)，中间精密度σ_P值(不超过2%)，α值(0.05)、1-β值(β=0.1)，得到n=5。

(2) 实验影响因素：对影响方法准确度和精密度的关键因素进行风险分析^[10]，同时考虑到实验室现有设备与人员条件，最终确定考察的因素有仪器、人员和运行间隔。

(3) 采取完全析因^[11]法，确定了包含3因素2水平的8个不同试验模式，见表 3。

表 3 8组试验的回收率结果 Tab.3 Recovery results of 8 groups of tests

试验模式 (test mode)	试验1(test 1) A1/E1/R1	试验2(test 2) A1/E1/R2	试验3(test 3) A1/E2/R1	试验4(test 4) A1/E2/R2	试验5(test 5) A2/E1/R1	试验6(test 6) A2/E1/R2	试验7(test 7) A2/E2/R1	试验8(test 8) A2/E2/R2
80%	100.83	100.04	100.84	101.67	100.07	100.80	100.32	101.05
80%	101.16	100.64	101.06	101.08	101.13	100.90	100.72	101.13
80%	100.52	99.96	100.66	101.37	100.87	100.26	100.80	100.88
90%	100.27	100.04	100.52	100.43	100.59	100.74	100.54	101.07
90%	100.65	99.54	101.21	100.61	100.07	100.77	100.25	100.79
90%	100.68	100.07	101.12	100.63	100.49	99.88	100.50	101.66
100%	100.27	100.42	100.86	100.28	100.82	99.84	100.96	101.45
100%	100.30	100.33	101.12	101.82	99.98	99.62	100.98	100.69
100%	100.26	100.58	100.39	100.99	100.82	99.50	101.14	100.73
110%	100.71	100.11	100.68	101.30	100.74	100.04	100.94	101.45
110%	100.84	99.95	100.53	101.24	100.77	99.64	100.51	101.00
110%	100.47	100.25	100.59	101.42	101.03	99.68	99.05	100.85
120%	100.16	100.00	100.40	101.33	100.47	99.53	100.00	101.26
120%	100.49	100.40	100.62	101.34	100.87	99.96	100.37	101.32
120%	100.47	97.69	100.12	101.13	101.01	99.93	99.63	102.20
注(note)：1.表中第一列的数字为该浓度相对于标示量的百分比；结果均表示为检测浓度与实际浓度的百分比(The numbers in the first column of the table are the percentages of the concentration relative to the labeled amount；the results are expressed as the percentage of the detected concentration to the actual concentration)；2. A表示“分析人员”，E表示“仪器”，R表示“操作”；1、2表示两个水平(A represents “analyst”，E represents “instrument”，R represents “run”；1，2 represents two levels)

表 3 8组试验的回收率结果 Tab.3 Recovery results of 8 groups of tests

(4) 浓度点的设置：结合USP < 1225 > 及ICH要求，一般可采用包含80%~120%的3个浓度点，考虑到外标法的使用可能会导致低浓度点，如80%的点产生的偏倚较大，为了更好地反映回收率情况，最终确定浓度考察点为80%、90%、100%、110%、120%。

5.3.2 操作步骤

精密称定双环醇原料药5份，分别置25 mL量瓶中，再向各量瓶中分别加入空白辅料120 mg，按“2.1”项下方法操作，得到质量浓度约为80、90、100、110、120 μg·mL^-1的溶液，即相当于标示量的80%~130%，每个浓度独立制备3份。按表 3进行8组实验，检测结果见表 3。

5.3.3 结果分析 5.3.3.1 准确度

“预测值-实际值”的线性：根据USP < 1225 > 的提议，可通过比较预测浓度和实际浓度的差异来评估准确度，期望其斜率接近1或置信区间包含1。因此对不同浓度下的“预测含量-实际含量”做了线性拟合，结果见图 4。可知线性方程：

$ Y = 0.999X + 0.158 $

图 4 准确度曲线 Fig.4 Accuracy curve

根据表 4，将斜率与1做检验，可知斜率与1无显著性差异(P=0.894 > 0.05)，并给出了斜率的95%置信区间[0.991，1.008]，包括1，满足USP < 1225 > 相关要求。

表 4 斜率的检验结果 Tab.4 Slope test results

表 5是根据软件评估准确度获得的的结果，可知平均偏倚为0.59%，且各浓度下的偏倚置信上下限均未超过±2%，因此在标示量80%~120%的范围内，方法的准确度均能满足需求。

表 5 各浓度下的准确度分析 Tab.5 Accuracy analysis at different concentrations

5.3.3.2 精密度

同时对表 3数据进行精密度评估，结果见表 6，可知总中间精密度为0.59%，且各浓度下的中间精密度上限均未超过1.43%，因此在标示量80%~120%的范围内，方法的精密度能够满足要求。

表 6 各浓度下的精密度分析 Tab.6 Precision analysis at different concentrations

5.3.3.3 方法能力评价

联合了方法的准确度与精密度，设置产品的可接受变异为±10%(因为产品的可接受标准即为90.0%~110.0%)，对总体方法能力进行评价，结果如表 7和图 5、6所示。可知在80.0%~120.0%的范围内，方法能力指数均达到了一级，由于方法变异造成的误判率可以忽略不计^[11]，此方法在该范围内能够很好地满足检测需求。

*目标值(target value) 图 5 95%/90%容忍区间 Fig.5 95%/90% tolerance interval

*目标值(target value) 图 6 95%预测区间 Fig.6 95% prediction interval

表 7 不同浓度水平下的方法能力评价 Tab.7 The evaluation of method capability at different concentrations

6 讨论与总结 6.1 科学的实验设计是保证方法性能参数可靠性的基础

以往含量测定的方法验证^[2-3]，多采用单独实验设计分别获得准确度和精密度；该方式割裂了这些参数的相互关系，使所获参数的可靠性受到损失^[12]。USP < 1210 > ^[5]所采用的实验设计虽然引入了多因素综合设计的方式(3个浓度，每个浓度制备3份样品得到9次实验结果)，但这种设计一旦出现浓度范围设置不当，如出现异常值或其他偶然变异因素，很可能导致对方法适用范围的损失或错误结论；同时，因每个浓度点的样本量过少，也无法获得可靠的准确度和精密度。

为克服上述设计的局限性，本实验首先根据方法的预期用途，选定不同的浓度范围，然后在充分考虑样本量^[13]基础上，对每个浓度点采用3因素2水平的完全析因设计^[9](2仪器、2人员和2运行间隔)进行8次实验，以确保每个浓度点所获得各方法性能参数真实可靠。

该设计除具有能获得各浓度点的可靠方法性能参数、有利于更好地判断方法适应范围外，还有利于从验证试验结果中计算出各因素的变异分量，从而识别出更多信息。如在本实验中：(1)通过方差分析可发现人员、仪器和运行间隔这3个主要因素中，不同仪器所产生的方差远大于分析人员和运行间隔，说明仪器是影响该方法的主要因素；进一步对仪器进行单独方差分析，发现仪器2的检测结果比仪器1产生更大的偏倚，说明就双环醇片的含量检测而言，仪器1的检测性能要优于仪器2。(2)根据各浓度点下的结果分布散点图，可以查找出异常数据点等。

6.2 含量测定类定量方法的判定标准或依据问题

目前，《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》) ^[2]和一些文献^[6]对含量测定类方法采用Horwitz方程给出的方式作为判断其满足预期用途的标准。欧洲官方药品检定实验室(Official Medicines Control Laboratories，OMCL)内部采用方法能力指数的方式进行判断，但其仅用精密度来代替方法的总变异(variability)。检测方法是判定药品质量的重要量具，而前述的判断方式或依据已被证明过于粗糙，不能作为判断检测方法的标准^[14]。

本文采用本专栏中《定量理化分析类方法满足预期用途的判断标准探讨》一文提出的方法能力指数和USP < 1210 > 容忍区间和预测区间的方式进行判断。方法能力指数的判断模式对于含量测定类方法，特别在已确定出所检测产品的质量标准时，更有利于根据方法误判率来判断方法是否可用，以及使用该方法的风险大小。本次实验结果表明，对产品的质量标准为90%~110%时，方法能力指数在80%~120%的范围内均在2以上，检测方法误判率可忽略不计。

本文所计算出的方法变异的预测区间和容忍区间^[15]也可评估方法是否适于其预期用途；但没有方法能力指数直接。这2个指数的优势是可以为后续方法确认和转移的判断提供依据，即进行方法确认或转移时，其个体检测结果有95%的概率应落在其预测区间内，所有检测结果的90%有95%的概率会落在容忍区间内。

6.3 《中国药典》中双环醇片的测定方法完全满足其预期用途

本次实验对于《中国药典》中收载的双环醇片的含量测定方法(即HPLC法)进行了更全面深入的验证：在标示量的70%~130%范围内，线性方程为Y=2050.868X+0.134(R² > 0.999 9)，回归线标准误(RSME)在0.30左右，符合要求。在标示量的80%~120%范围内，准确度中的最大相对偏倚发生在80%标示量点(0.78%)；精密度中的最差浓度点发生在120%标示量点(中间精密度值为0.89%)。各浓度点的方法总变异位于0.67%~0.87%范围内，95%/90%容忍区间位于98.11%~102.78%范围内，95%预测区间位于98.95%~101.95%范围内。对于检测质量限度标准为98.0%~102.0%的原料药，其方法能力指数在0.8以上(Ⅳ级)，方法的误判率不超过0.8%；对于检测质量限度标准为90.0%~110.0%的终产品，其方法能力指数均在2.0以上(Ⅰ级)，方法的误判率可忽略。综上可见，该方法可用于双环醇原料药和终产品的含量检测。

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