药品质量的有效控制，离不开科学可靠的评估方法。开发一系列稳健可靠、简便快捷的分析方法，已成为药物分析领域所关注的热点，也是创新发展，占领学科发展前沿的重要指标。各国药典和质量控制的技术指南很早就建立了方法验证的指南。

方法验证的概念具体从何时提出，作者没有详细考证，但可以肯定其是随着现代工业化生产的需要而产生。从对国际标准组织ISO9000文件溯源看^[1]，“验证”的概念约在1986年被提出ISO8402：1986，之后，ISO组织虽对该文件进行了5次改版(1986和1994年，ISO8402 Quality-Vocabulary；2000、2005和2015年，ISO9000 Quality Management Systems-Fundamentals and Vocabulary)，但对“验证”一词的定义基本一致，即“通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定”^[2]。美国食品药品监督管理局(FDA)于1987年首次正式提出对分析方法应该进行验证的要求^[3]。不同的技术指南文件虽对方法验证定义的表述不完全一致，但其核心思想没有本质区别。

尽管各国药品监管部门对方法验证都非常重视，但方法验证的发展却经历了一个随着科技发展和实践应用的需求逐步科学化、规范化的漫长过程。经过近30年的努力，人们对方法验证具体的实施和参数要求越来越严谨和科学。2016年作者曾对当时的一些研究进展进行了介绍^[4]。下面对方法验证起重要推动作用的各国指南进行简要评述，并讨论方法验证中几个关键问题的解决思路。

1 FDA

现行版FDA^[3]关于方法验证的指南共经历了3个版本的演变，即1987年起草的“Guidelines for Submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation”、2000年起草的企业指南“Analytical Procedures and Methods Validation”和2015年最新起草的企业指南“Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics”。

2010年以前，FDA对于方法验证的相关规定主要是关注方法的分类和主要的方法验证性能参数，即准确度、精密度(重复性和中间精密度/再现性精密度)、线性、范围、检测下限(limit of detection，LOD)和定量下限(limit of quantification，LOQ)。限于当时一些理论支持研究不足，对方法评价的指标计算问题也没有提出更深入的要求。

2015年，结合新引入科学理论和实践中遇到的问题，FDA对方法验证进行了全面改版。现行的FDA指南主要明确了下列内容：(1)进一步明确了该指南的适应范围，即适于原料药、制剂、杂质或生物液体中的化合物等理化分析方法的验证；不适于生物和免疫学方法的验证。(2)引入了方法生命周期的管理理念：方法评估涵盖方法开发(development)、验证(validation)、确认(verification)和转移(transfer)等，属方法生命周期的管理内容；在产品生命周期中遇到生产工艺变化时，要基于风险分析考虑现有方法的验证需求。(3)引入质量源于设计(quality by design，QbD)理念，提出方法验证的规范设计要求：方法评估应在方法早期的耐用性研究中采用系统设计方式(如方法参数的实验设计)，始于初始风险评估，采用多变量实验设计等。(4)提出评估方法特性(如准确度、精密度等)时需考虑其用途：如从生产工艺的中间产品至成品的不同样品要求问题。(5)提出统计规范化要求：如对方法验证更多性能参数的统计计算^[5-7]、统计分析的前提条件及计算注意事项；还提醒了选用统计模型和选择统计分析软件等注意事项。(6)其他更广泛的要求：如方法替代(alternative research)的比较要求、方法验证报告的要求等。

由于方法生命周期概念的引入，FDA对方法在整个生命周期中应该进行的各评估内容进行了概括性归纳，这是一个全新系统性的权威文件。其中的方法生命周期理念，也已引起美国药典委员会的注意，并开始考虑在其指导原则 < 1225 > 中加入或对其重新修改^[8]。该指南虽然提到对方法验证性能参数的计算规范性，但未给出具体的规范要求，对使用者而言还存在诸多不便。

2 美国药典(USP)

1990年的USP 22正式收载“方法验证”纲领性指导文件 < 1225 > ^[9]，该文件对于保证一个方法作为法定方法，起到了科学、规范的作用，也为其广泛应用奠定了坚实的基础。该文件最初仅列出了3类分析方法的方法验证：用于检测主成分(包括防腐剂)的Ⅰ类方法、用于检测杂质或降解产物的Ⅱ类方法(包括定量(Ⅱa)类和限度(Ⅱb)类方法)、用于溶出度/释放度等性能评价的Ⅲ类方法。2000年的USP 24版，在该文件中修改增加了鉴别(Ⅳ)类方法^[10]。该文件为2005年的ICHQ2(R1)第1版打下了基础。

但由于其过于笼统，在实施过程中遇到很多具体问题。从1990年至今，USP对其概念不断进行完善，同时开展了相关研究工作，分别于2007年相继提出了方法确认(verification)的概念及相关原则^[11]，于2012年提出了方法转移的相关概念和指导原则^[12]。然而，这些文件的补充仍然无法完全解答科研工作者所有的困惑，特别是一些关键问题，如关于验证参数需要达到什么标准才能满足需求，如何获得可靠的性能参数从而保证所验证结果的科学性等。

为使方法验证工作更完善和科学，美国药典委员会在2010年专门成立了关于方法验证的研究课题组。该课题组不仅有药品分析领域的专家，还有统计学专家等跨专业人才。他们从实际应用中存在的问题出发，结合QbD理念和统计理论，对方法验证的性能参数进行全面系统的研究。经过近8年的努力，历经多个文件和版本^[13-14]的反复推敲，终于在2018年的USP 41-NF 36中，确立并正式收载了关于方法验证中对性能参数进行科学评价的第1个统计分析指导原则，即 < 1210 > Statistical Tools for Procedure Validation^[15]。该指导原则具有以下特点：

(1) 对于定量类分析方法，包括主成分含量测定(Ⅰ)类方法和杂质定量测定(Ⅱa)类方法，采用方法变异度方式，即方法的准确度-精密度联合评价的方式进行评价，提出了评价方法满足预期用途的新参数，即方法变异的容忍区间和预测区间。

(2) 否定了原来提出的使用Horwitz方程作为方法满足要求的判断依据。

(3) 明确了计算LOD使用回归线95%预测区间的方法；阐述了LOQ与新给出的检测限间的相互关系，并强调给出线性回归的决定系数和回归线标准误(RSME)。

(4) 删除了很多原有的理论论述，如模型评价、不同实验设计的效能等^[14]。

(5) 给出了具体操作实例，以便于使用者理解。

(6) 该文件的缺点：没有对专属性给出相关评价信息；在评价方法满足预期用途方面，没有涉及与产品质量标准的关系。该文件也不包含对溶出度/释放度的Ⅲ类方法验证评价的内容(将另文论述)。

相信随着USP专家对FDA关于方法验证指南(方法生命周期)内容^[3]的理解，日后还会对其收载的内容进一步优化调整。

3 欧洲官方实验室

欧洲官方实验室(network of official medicines control laboratories，OMCL)也非常重视方法的验证。从2000年起，专门制定并起草了相关文件^[16]。但OMCL的文件与美国FDA和USP的文件有很大区别：美国FDA关于方法验证的指导性文件主要针对企业，USP主要从方法学角度进行更为详细的说明，OMCL则从官方实验室的角度入手。

在起草方法验证文件时，首先将检测方法以不同使用阶段需要提供的方法验证性能参数入手提出相应要求，如关于方法转移，提出了对药典(技术指南)方法的转移、生产商方法的转移、非法定发布方法的转移等验证的要求。对于新的分析方法，也提出了与ICH所收载文件的相似要求。目前该文件^[16]已经过3次审查，但变化不大。为了更好地对方法进行评价，OMCL对方法是否满足预期用途的标准也进行了相应探讨，并从不确定度的角度出发，提出了相应的标准^[17]。

然而，该指南文件^[17]将检测时所有的不确定度全部归为方法的精密度，本身就存在缺陷。若仅从方法能力指数的角度分析(见本专栏中的《定量理化分析类方法满足预期用途的判断标准探讨》)，文件所提供的判定标准也是对方法满足预期用途的最低要求。

4 人用药品注册技术要求的国际协调会议(ICH)

人用药品注册技术要求国际协调会议(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH)最早是美、欧、日三方成立的专门协调人用药品注册的技术指南协调组织。该组织从1993年^[18]就提议协调方法验证的技术要求。1994—1996年形成现行版ICHQ2(R1)的雏形(Q2A和Q2B)。经过2005年的最终协调，形成现行版ICH Q2(R1)。

该文件中仅将分析方法分为3类，即鉴别类、有关物质检测类和分析(assay)类，其中将溶出度测定类方法归于分析类中，但USP将其作为单独一类方法(Ⅲ类)。从2005年成型后，一直没有将新研究进展吸收于其中。随着近10年来技术的发展和进步，该指南已经无法回答实施中遇到的具体问题。正是意识到这一点，ICH在2018年6月22日的Press Release^[19]中宣布，将对该文件进行全新修订。期望它能早日吸纳最新的研究成果，形成更具实际指导力的国际性技术指南。

5 《中华人民共和国药典》和国家标准

《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)自2000年开始收载方法验证的指导原则^[20]。该指导原则一直使用“验证”一词表达“validation”，内容以ICH文件为基础，也将验证方法的类型归为3类，将溶出度/释放度实验与含量测定实验归为Ⅰ类。2005年版和2010年版内容未做改动，在2015年版修订时增加了判断方法满足预期用途的标准^[21]。然而，该标准采用Horwitz方程，该方程目前在国际上已被否认^[22]，且USP也放弃使用该标准。

由于理化分析方法应用广泛，我国也对该类方法制定了相应的国家标准^[23]。但在该标准中，将“validation”一词翻译为“确认”，而不是“验证”。

这种对重要专业术语的不同翻译，给科研工作者带来了不便和困惑。此外，国内在对方法验证进行系统的方法学研究起步较晚，相关研究成果和报道较少。

6 讨论 6.1 分析方法验证技术指南的发展历程

此历程大致可分为3个阶段。第1阶段：20世纪80年代后期至90年代末期。在该时期，药品领域的专家开始重视方法验证的重要性，并着手起草并规范方法验证的指导原则或技术指南。其中以USP在1990年正式收载该指导原则^[9]为标志。第2阶段：1990—2010年。各国的药品领域专家对理化分析方法技术指南中的不同处进行协调统一并开始实践应用。此时的一个重要标志是形成具有广泛影响力的ICH Q2(R1)^[18]，其主要关注点是提供哪些方法验证基本参数问题。第3阶段：2010年至今。经过了第2阶段的推广实施，加上一些新理念的引入(QbD和生命周期)，药品领域专家对方法验证中的一些基本问题深入反思，并协同统计学专家进行跨学科研究和评估。目前，药品领域的方法学研究专家主要围绕解决下面3个问题：(1)判断一个方法是否满足预期用途的标准及其科学性；(2)哪些参数更能直接或更好地表达方法是否满足预期用途；(3)如何获得可靠的方法验证参数。

6.2 USP < 1210 > ^[15]及存在问题

USP在最新收载的 < 1210 > 中，对方法验证中的上述3个基本问题提出了自己的规范：(1)判断一个方法满足预期用途的更可行方式(相比于Horwitz方程)是使用方法变异的容忍区间和预测区间。(2)为更好地判断准确度、精密度、检测下限和线性的变异，需提供下列变异性描述性指标：准确度的置信区间、精密度的置信上限和线性的残差分布，对检测下限的确定采用回归线95%预测区间。(3)要获得可靠的性能参数，需要进行全面的风险分析和科学的实验设计(析因或嵌套)。然而，这些方式是否能满足方法验证的需要，还在进行更广泛的探索。一些专家从另外的角度发表了不同的观点：如，OMCL从方法不确定度^[16]的角度给出了方法满足预期用途的判断方式；本专栏中，提出了使用方法能力指数的方式(参见本专栏《定量理化分析类方法满足预期用途的判断标准探讨》一文)作为方法满足预期用途的判断依据。相信随着研究的深入，最终会解决这些问题。

6.3 《中国药典》中方法验证的指导原则值得商榷的内容

(1)《中国药典》从第1次收载该指导原则起，一直将“method validation”表达为“方法验证”，而国内其他领域，甚至包括医疗器械的技术指南或指导原则，都表达为“方法确认”；国家标准也将“validation”翻译为“确认”^[24]；也有文章专门探讨validation和verification 2个专业术语的翻译问题^[25]。本文及本专栏中的其他文章，统一沿用《中国药典》的表述，但无论如何，关键术语的混乱问题应该尽早解决，以免造成研究和应用时的混乱。(2)目前《中国药典》2015年版四部有2个关于方法验证的指导原则，即 < 9012 > ^[26]和 < 9101 > ^[21]，其本质均是对理化分析方法的验证，只是检测的样品不同，前者为生物样品，后者强调的是化学药品。作为国家统一的药品法典，建议国家药典委员会借鉴FDA文件^[3]，对这2个指导原则进行有机整合，形成统一标准。(3)方法验证是对检测方法的方法学研究，需要跨学科综合，尤其是统计学方法的引入，将更好地促进药品分析方法学的开发。