硫酸小诺霉素为氨基糖苷类抗生素，由于其抗菌谱较广，对革兰阴性菌和革兰阳性菌的敏感菌均显示抗菌活性，且副作用小，价格低，在临床中被广泛应用^[1-2]。

与其他的氨基糖苷类药物相似，硫酸小诺霉素具有强极性、非挥发性且紫外吸收信号不明显等特征，这些特征给氨基糖苷类药物的分析带来了很大的挑战。早期药物分析人员采用对硫酸小诺霉素进行衍生化反应，使其产生紫外吸收，从而进行液相色谱分析。但是衍生化反应效率较低，且存在反应不完全产生副产物而导致结果偏差的可能^[3]。《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015年版采用蒸发光散射检测器(ELSD)对小诺霉素组分进行分析。尽管蒸发光散射检测器号称为广谱检测器，但是同样存在局限性。首先，蒸发光散射检测器的峰面积与样品进样量不成正比，需要将其换算成对数值再计算线性，这必然导致结果的准确性降低；其次，蒸发光散射需要挥发性物质作为媒介，这就导致流动相可选择性范围很小；除此之外，不同的仪器参数、不同的仪器品牌均能影响蒸发光散射测定结果的重现性。

据文献报道，液相色谱-脉冲安培检测器目前已经成功用于硫酸新霉素^[4]、硫酸依替米星^[5]、庆大霉素^[6-7]、卡那霉素^[8]、阿米卡星^[9]、盐酸大观霉素^[10]等药品的分析中，该检测器有灵敏度高、稳定性好等特点。其中，脉冲安培检测器对硫酸依替米星的分析应用已经收入于《中国药典》2015年版二部中。本文将采用液相色谱-脉冲安培检测器对小诺霉素组分进行分析。

1 仪器和试剂

DIONEX ICS-5000+ DP(液相色谱安培检测器)(赛默飞世尔科技有限公司)，DIONEX ICS-5000+ DP(安培检测器，赛默飞世尔科技有限公司)，MS105型电子天平(METTLER TOLEDO)。水为Millipore超纯水。对照品小诺霉素(批号130342-201404，含量51.8%)、庆大霉素C1a，(批号130515-201603，供系统适用性试验用)和西索米星(批号130635-201301，含量56.0%)由中国食品药品检定研究院提供。三氟乙酸(含量≥99.5%；规格约100 mL；批号432291000)、五氟丙酸(含量100.0%；规格100 mL；批号110728-201506)、氢氧化钠(含量≥96.0%；规格约500 g；批号20110919)、乙腈(色谱纯；规格4 000 mL；批号110710-201619)。硫酸小诺霉素氯化钠注射液6批，江西制药责任有限公司提供，批号分别为170314111、170315111、170316111、170317111、170318111、170319111。

2 方法和结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品储备液

称取小诺霉素对照品96.20 mg，加超纯水溶解并稀释至50 mL，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液

精密量取本品5 mL，置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，制成每1 mL中约含小诺霉素0.030 mg的溶液，作为供试品溶液，摇匀，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱：Ionpac^TMAMG^TM(3 μm，4.0 mm×150 mm)；以1.25%(v/v)三氟乙酸溶液[含0.025%五氟丙酸，0.85%(v/v)50%氢氧化钠溶液，用0.5 mol·L^-1氢氧化钠溶液调节pH至2.6]-乙腈(97.5: 2.5)为流动相；柱温30 ℃；流速0.7 mL·min^-1，柱后加0.5 mol·L^-1的氢氧化钠溶液冲洗，流速0.3 mL·min^-1；进样体积20 μL。

2.3 系统适应性试验

取庆大霉素C1_a、西索米星、小诺霉素对照品各适量，配成浓度分别为30 μg·mL^-1的混合对照品溶液，精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，各峰的分离度符合《中国药典》要求。色谱图见图 1。

2.4 线性范围

精密吸取对照品储备液1、1.5、2、2.5、3 mL，分别置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配制成小诺霉素质量浓度分别为19.93、29.90、39.86、49.83、59.80 μg·mL^-1的溶液。分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X(μg·mL^-1)为横坐标，得回归方程：

Y=1.484X+1.344  r=0.999 6

结果表明，小诺霉素质量浓度在19.93~59.80 μg·mL^-1范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取小诺霉素质量浓度为39.86 μg·mL^-1的对照品溶液，连续进样6针。以主峰的峰面积计算，得RSD为0.55%(n=6)结果显示精密度良好。

2.6 重复性试验

分别精密量取同一批号样品(170314111)6份，按“2.12”项下方法制备供试品溶液，精密吸取20 μL，注入色谱仪，测定峰面积并计算小诺霉素含量。结果小诺霉素的平均含量为0.541 0 mg·mL^-1，RSD为1.2%(n=6)重复性试验结果符合要求。

2.7 回收率试验

精密量取已知含量样品9份各5 mL，置50 mL量瓶中，再按照80%、100%和120% 3个水平分别精密加入小诺霉素对照品17.51、22.73和26.96 mg，加纯化水稀释至刻度，摇匀。精密吸取20 μL注入液相色谱仪，测得峰面积并计算含量，结果小诺霉素平均回收率分别为99.1%，RSD=0.39%(n=9)。结果表明该方法的准确度较好。

2.8 定量下限

取对照品溶液逐步稀释，按上述色谱条件测定，定量下限按S/N=10计算，为5.98 μg·mL^-1。

2.9 稳定性试验

精密量取本品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中约含小诺霉素0.030 mg的溶液。将供试品溶液放置0、4、8、14、48 h，吸取20 μL注入离子色谱仪，测定小诺霉素组分含量。计算RSD为1.1%。结果表明，供试品溶液48 h内稳定。

2.10 样品测定

采用本法测定6批硫酸小诺霉素氯化钠注射液中小诺霉素的含量。取样品，按“2.1.2”项下方法配制供试品溶液。精密吸取20 μL，注入色谱仪，色谱图见图 2。

3 样品测定结果比较

采用《中国药典》2015年版的蒸发光散射检测方法对该6批硫酸小诺霉素氯化钠注射液的小诺霉素组分进行了比较测定。精密量取供试品溶液和对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，分别计算样品中小诺霉素含量，结果见表 1。

4 讨论

《中国药典》2015年版采用ELSD法对小诺霉素组分进行检测分析。与蒸发光散射相比，液相色谱-脉冲安培具有稳定性好、重复性高、灵敏度强等特点。蒸发光检测检出限约为320 mg·L^-1，本文采用的脉冲安培检测方法的定量限为5.98 μg·mL^-1，灵敏度得到了很大的提升。用《中国药典》方法测定相同6批样品的小诺霉素组分，与本方法的测定结果进行比较，结果表明，两者无显著差别。脉冲安培检测为小诺霉素含量测定提供了新的检测方法。