舒肝宁注射液是由茵陈、栀子、黄芩、板蓝根和灵芝提取物制备而成的中药注射剂^[1-2]，具有清热解毒、利湿退黄、益气扶正和保肝护肝的功效，在临床已广泛使用，主要用于治疗黄疸和急、慢性病毒性肝炎^[3-5]。在临床使用过程中，舒肝宁注射液的不良反应发生率较高，轻者为皮疹、瘙痒、畏寒、发热，严重的可致过敏性休克^[6-7]。目前对舒肝宁药物的质量研究仅限于其中1~2个成分的含量测定，未见对舒肝宁注射液中多个有效成分的研究，难以全面控制其质量。而且已有文献多采用HPLC-UV法对舒肝宁注射液进行测定^[8-11]。UPLC-MS/MS由于测定时间短，分离度好，尤其适用于复杂样品的定性和定量，在中药多组分的测定中明显优于传统的HPLC-UV法^[12]。本研究采用UPLC-MS/MS法同时测定舒肝宁注射液中的绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷、表告依春的含量，具有快速、灵敏、准确、特异性强等特点，可以较好地消除有效成分之间的干扰。

1 仪器与材料 1.1 仪器

超高效液相色谱系统(Shimadzu 30A UPLC system，Kyoto)，配有二元高压梯度泵(Shimadzu 30AD)，柱温箱(Shimadzu CTO30A)和自动进样器(Shimadzu SIL30AC)；AB Sciex Triple QuadTM 5500型串联四极杆线性离子阱质谱仪(Applied Biosystems公司)，含有Turbo V离子源和三重四极杆线性离子肼串联质量分析器。数据采集软件：Analyst 1.6。BP211D型分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，雷勃尔LG16-B高速离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)。

1.2 试剂

对照品绿原酸(批号LYS2015041901)、栀子苷(批号ZZG2016052501)、黄芩苷(批号HQG2016031211)、黄芩素(批号HQS2016061601)、野黄芩苷(批号YHQG2016042501)、表告依春(批号BGYC2015061110)均购自南京春秋生物工程有限公司，纯度均大于98%；甲醇、甲酸为色谱纯(赛默飞世尔(中国)有限公司)；水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2 方法与结果 2.1 色谱-质谱条件 2.1.1 色谱条件

采用XBridge^® BEH C₁₈色谱柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)，流动相A为乙腈(色谱纯)，流动相B为含0.05%甲酸水。梯度洗脱：0~3 min，25%A→90%A；3~5 min，90%A→90%A。每针进样前平衡5 min；流速：0.3 mL·min^-1；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。对照品和样品色谱图见图 1。

2.1.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI源)，离子源温度为600 ℃，正负离子同时监测模式，Turbo V离子源。源喷射电压为正离子模式5.5 kV，负离子模式−4.5 kV；雾化气(gas 1)和加热气(gas 2)分别为414、448 kPa，帘气为172 kPa，接口处加热，多反应监测模式(MRM)。绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷、表告依春的MS参数见表 1。二级质谱图见图 1。

2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液

分别精密称量绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷、表告依春对照品适量，加甲醇分别制成对照品溶液。分别取各对照品溶液适量，加甲醇制成绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷、表告依春质量浓度分别为48.00、140.0、4 000、550.0、122.4和96.00 ng·mL^-1的混合对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液

分别精密量取不同批次舒肝宁注射液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度；再精密量取该溶液1 mL，置另一个100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。用0.22 μm微孔滤膜过滤，取澄清的续滤液作为供试品溶液, 即得。

2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系、定量下限和检测下限

精密量取上述混合对照品溶液适量，采用倍数稀释法，用甲醇分别稀释制得不同质量浓度梯度的系列标准溶液，按“2.1”项下色谱和质谱条件进行分析，记录各个成分的峰面积。以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程、相关系数及线性范围见表 2。将混合对照品溶液逐步稀释，分别以信噪比S/N=3和S/N=10时各对照品的浓度作为检测下限和定量下限，结果见表 2。

2.3.2 精密度、稳定性和重复性试验

精密吸取同一混合对照品溶液，连续进样6次，计算各成分峰面积的RSD，6个成分的RSD分别为绿原酸2.1%、栀子苷2.0%、黄芩苷1.2%、黄芩素2.4%、野黄芩苷2.6%、表告依春1.8%，表明仪器精密度良好。

将样品(批号20161024)的供试品溶液在室温下放置0、2、4、6、8、12 h后分别进样，记录峰面积，计算各成分峰面积的RSD，依次为绿原酸1.5%、栀子苷1.9%、黄芩苷2.2%、黄芩素2.2%、野黄芩苷1.9%、表告依春2.2%，表明供试品溶液室温放置12 h稳定。

按“2.2.2”项下方法制备样品(批号20161024)的供试品溶液，共6份，进样分析，测得绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷、表告依春的平均含量分别为51.25、552.3、192.14、225.1、123.7、30.98μg·mL^-1，RSD分别为1.2%、1.0%、2.1%、0.97%、1.8%、2.2%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.3 回收率考察

精密量取6份同一批供试品(批号20161024)溶液500 μL，置于100 mL量瓶中，将6个成分对照品储备液适量分别精密加入到各量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.2.2”项下方法操作，制备供试品溶液进样测定，计算平均回收率，结果见表 3。

2.4 样品测定

取5批不同批号的舒肝宁注射液药品各3份，按照“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱-质谱条件进样分析测定，记录6个被测物的色谱峰面积，代入各成分相应的标准曲线，分别计算绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷、表告依春的含量，结果见表 4。

3 讨论

《伤寒论》方茵陈蒿汤由茵陈蒿、栀子及大黄三味药组成^[13]，舒肝宁为中药制剂，其组方为“茵陈蒿汤”加减而来。舒肝宁在茵陈蒿汤基础上加入板蓝根及灵芝，同时改大黄为黄芪。板蓝根具有清热、解毒、凉血、利咽的功效，可提高慢性肝炎患者免疫力^[14]；黄芪性温味甘，具有益气升阳、固表止汗功效，主治一切气虚血亏之证，调节机体免疫力^[15]；灵芝味淡性温，具有补中益气的功效^[16]，与黄芪合用有助于提升慢性乙型肝炎患者由于长期病情迁延不愈所致抵抗力低下。

在试验过程中，为了选择最佳的化合物离子进行MRM模式的定量分析，分别配制纳克级的对照品溶液注入质谱仪，在离子扫描中，栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷、表告依春化合物在正离子模式下的响应值明显高于负离子模式下的响应值，而绿原酸只在负离子模式下的响应比较好，因此选择用正负离子同时监测模式进行检测。每个化合物离子对的最优DP CE见表 1。

将不同的电解质(甲酸、乙酸以及醋酸铵)加入流动相以考察对各化合物峰形及响应值变化的影响，结果显示，甲酸优于乙酸和醋酸铵。进一步对甲酸在流动相中的比例进行考察，发现0.05%甲酸水溶液能使被测成分达到稳定的响应值和最佳的分离效果。同时对甲醇和乙腈进行了对比，结果发现使用乙腈时的峰形和分离度较好，所以选择乙腈和0.05%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱。

《中华人民共和国药典》2015年版目前还没有舒肝宁注射液的质量标准，为全面有效控制舒肝宁注射液的质量，本文采用UPLC-MS技术建立有效成分定量测定的方法，可在短时间内(5 min)准确、快速地分析测定舒肝宁注射液中6个成分，包括绿原酸、栀子苷、黄芩苷、黄芩素、野黄芩苷、表告依春，可为进一步完善舒肝宁注射液的质量标准提供参考，保证该制剂在临床应用中的安全性和有效性。