复方氨基酸(15)双肽(2)注射液，为肠外营养制剂，用于不能口服或经肠道补给营养，以及营养不能满足需要的患者，特别是处于高分解代谢的患者。柠檬酸是药品处方中的常见组分，广泛用作香料和稳定剂。柠檬酸作为缓冲试剂，可增强制剂的稳定性，并且增强抗氧化效力。检测复方氨基酸双肽注射液中的柠檬酸含量，对其质量控制和标准的完善具有重要意义。

复方氨基酸双肽注射液成分复杂，由15种L-氨基酸和2种二肽组成，同时包括柠檬酸在内的制剂中的多数成分均无明显紫外吸收，各氨基酸及其他辅料多为离子成分，极易干扰柠檬酸的测定。

现有文献中柠檬酸检测方法，主要有高效液相色谱法^[1-4]、离子色谱法^[5-8]、比色法^[9-10]、近红外光谱法^[11-12]、火焰原子吸收光谱法^[13]、气相色谱法^[14]等。目前国内外药典及文献中均未对复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中柠檬酸进行控制。

本实验尝试采用离子交换色谱法进行复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中柠檬酸的分离检测，方法采用在线淋洗液发生器，操作简单，重复性强；选用抑制型电导检测器，主成分氨基酸受抑制，不影响柠檬酸的检测。最终建立了利用离子色谱法测定复方氨基酸双肽注射液中柠檬酸含量的方法。经方法学验证，本法重复性好，专属性和耐用性强，对全面考察复方氨基酸注射液成分，提升复方氨基酸注射液质量水平具有重要意义。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Thermo Dionex ICS-5000+型离子色谱仪，包括自循环模式的阴离子电解再生抑制型电导检测器(DIONEX AERS 500 4-mm抑制器)、EGC-500型淋洗液自动发生器(配有连续再生阴离子捕获(CR-TC)装置)、Chromeleon 7.2色谱工作站(Thermo Fisher Scientific公司)；ME204型万分之一电子分析天平(Mettler-Toledo公司)；XP205型十万分之一电子分析天平(Mettler-Toledo公司)；Milli-Q Integral型超纯水器(Merck Millipore公司)。

1.2 药品与试剂

柠檬酸对照品(公司：东京化成工业株式会社，批号：8V5TL HA，纯度：98.0%)。市售复方氨基酸(15)双肽(2)注射液：生产企业A，样品2批(批号：20140801、20140802)；生产企业B，样品3批(批号：14121601、14121701、14121801)。水为超纯水。

2 方法与结果 2.1 色谱条件和系统适用性

色谱柱：分析柱Thermo Dionex IonPac^TM AS11-HC(4 mm×250 mm)；保护柱Thermo Dionex IonPac^TM AG11-HC(4 mm×50 mm)；淋洗条件：氢氧化钾溶液，浓度梯度淋洗(见表 1)；流速：1.0 mL·min^-1；柱温：35 ℃；进样量：20 µL；检测方式：抑制型电导检测器，抑制电流：186 mA。在此色谱条件下，柠檬酸的色谱峰峰形良好，保留时间为13.883 min，理论塔板数53 836；系统适用性溶液中SO₃^2-与SO₄^2-色谱峰的分离度为1.30。

2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液

精密称取柠檬酸对照品适量，加超纯水溶解并稀释成每1 mL中约含柠檬酸20 μg·mL^-1的溶液，滤过，取续滤液作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液

复方氨基酸(15)双肽(2)注射液用超纯水稀释为每1 mL中约含柠檬酸20 μg·mL^-1的溶液，滤过，取续滤液即得。

2.2.3 空白溶液

以超纯水作为空白溶液。

2.2.4 系统适用性溶液

称取亚硫酸氢钠和硫酸铵适量，加超纯水溶解并稀释成每1 mL中约含亚硫酸氢钠和硫酸铵分别10 μg·mL^-1的溶液，滤过，取续滤液作为系统适用性溶液(色谱图见图 1)。

2.3 专属性试验

取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各20 μL注入离子色谱仪，色谱图见图 2。结果，在本色谱条件下，空白溶液和供试品溶液中的其他成分在柠檬酸峰的保留时间处无色谱峰出现，表明本方法的专属性良好。

2.4 线性关系考察

精密称取柠檬酸0.202 0 g于200 mL量瓶中，用超纯水稀释至刻度，摇匀。取上述溶液用超纯水逐级稀释，得相当于柠檬酸浓度分别为63.13、31.56、15.78、7.891、3.945 μg·mL^-1的系列对照溶液。按“2.1”项下色谱条件进样。以样品浓度(X，μg·mL^-1)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，拟合回归方程：

Y=0.046X-0.038  r=0.999 5

本色谱条件下，柠檬酸浓度在3.945~63.13 μg·mL^-1范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 定量下限与检测下限

取“2.2.1”项下对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10: 1时，得定量下限(LOQ)；当信噪比为3: 1时，得检测下限(LOD)。结果，柠檬酸的LOD和LOQ分别为0.102 7 μg·mL^-1和0.245 4 μg·mL^-1。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下对照品溶液20 µL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，柠檬酸峰面积的RSD=0.85%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液(批号20140801)，在室温下放置0、1、2、3、4、5、6、7、8 h后分别进样测定，记录色谱图。结果，柠檬酸峰面积的RSD为1.6%(n=8)，表明供试品溶液在室温条件下8 h内稳定。

2.8 重复性试验

取20140801批样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，6份供试品溶液中柠檬酸的平均含量为187.1 μg·mL^-1，RSD为1.3%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.9 回收率试验

取批号为20140801的复方氨基酸(15)双肽(2)注射液(已知含量36.38 μg)，稀释10倍，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液2.0 mL，分别置9个10 mL量瓶中，分别加入质量浓度为126.1、157.8、200.1 μg·mL^-1的柠檬酸对照品溶液1 mL各3份，置10 mL量瓶中，用超纯水稀释至刻度，制成质量浓度约为16、20、24 μg·mL^-1的溶液，分别进样，记录色谱图。柠檬酸的平均回收率(n=9)为102.4%，RSD为0.35%，表明该方法有良好的回收率。

2.10 方法耐用性

取批号为20140801的复方氨基酸(15)双肽(2)注射液，在不同流速(±0.1 mL·min^-1)、柱温(±3 ℃)等条件下测定，各条件下，柠檬酸色谱峰理论塔板数均大于10 000，柠檬酸与SO42-色谱峰的分离度均大于2。表明本方法耐用性良好。

2.11 样品含量测定

取两厂家5批注射液，按“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，按外标法计算柠檬酸含量。注射液中柠檬酸含量计算结果见表 2和图 3。

3 讨论 3.1 分离方法的选择

文献^[1-4]中大多采用反相高效液相色谱法对柠檬酸盐进行分离，需要淋洗液的pH很低，以抑制柠檬酸的电离，增强分离效果，而较低的pH对色谱柱的耐受性要求较高，因此反相色谱法未被采用。复方氨基酸双肽注射液成分复杂，主成分由L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸醋酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸15种L-氨基酸和一水合甘氨酰谷氨酰胺、二水合甘氨酰酪氨酸2种二肽组成。本文曾尝试利用离子排斥色谱法在210 nm处检测复方氨基酸双肽注射液中柠檬酸，但由于其他氨基酸成分的干扰，无法正常测定柠檬酸含量。

3.2 离子色谱法的优势

离子色谱法采用在线淋洗液发生器，自动生成浓度梯度的氢氧化钾，操作简单，重现性强^[15]。本文采用带有抑制型电导检测器的离子色谱法检测柠檬酸，主成分氨基酸及二肽到达抑制器后电离受抑制，且经实验验证，各单一主成分通过抑制器后在电导检测器均无响应，不影响柠檬酸的检测。

3.3 制剂处方差异

最终建立了利用离子色谱法测定复方氨基酸(15)双肽(2)注射液中柠檬酸的含量，本项目研究结果显示，由于不同企业采用不同处方工艺，制剂中阴阳离子成分差异较大，在注射液质量研究和评价工作中，关注离子成分的差异很有必要。

3.4 小结

本文建立的方法为复方氨基酸制剂中柠檬酸的检测评价提供了方法学依据，对复方氨基酸(15)双肽(2)注射液的质量控制和标准的完善具有重要意义，该方法也适用于其他处方类型注射液中柠檬酸的质量控制。