2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase）[1]，主要通过破坏细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，在渗透压的作用下导致革兰氏阳性菌细胞壁破裂，内容物逸出而使细菌溶解[2]从而发挥抗菌、消炎等作用。
人溶菌酶是人体内自有的一种碱性球蛋白，由130个氨基酸组成，相对分子质量14 700，有4个二硫键[3]。在人体广泛分布于体液、细胞和组织器官中[4-5]。人溶菌酶和人体具有天然相容性，当在临床上应用时，比其他溶菌酶更安全，且没有刺激性和副作用[6-7]。近年来，国内外采用DNA重组技术，成功开发出重组人溶菌酶（recombinant human lysozyme，rhLYZ），可利用原核或真核表达系统进行大规模生产。rhLYZ目前在国际国内有相关的学术性研究[8]，但未见有公司企业规模化生产的报道。本公司致力于rhLYZ的研发生产工作，采用毕赤酵母真核表达系统，经高密度发酵，精细纯化获得大批量高纯度的rhLYZ冻干粉。
溶菌酶的测定方法有分光光度计法[9]和流动注射化学发光法[10]，天然产物中的溶菌酶测定有关于HPLC法[11]的文献报道。但rhLYZ含量及纯度相关的质量检测方法罕有文献报道。为了更好地对rhLYZ相关产品进行质量控制，通过查阅相关文献[12-18]及大量试验，本研究建立了rhLYZ的RP-HPLC检测方法，可快速准确地检测rhLYZ的含量及纯度。
1 仪器与试剂日立高效液相色谱仪（L-2000），Ohaus Corporation电子天平（万分之一），色谱柱：Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）。超纯水（电阻率不低于18.2 MΩ·cm）、乙腈（色谱级，Fisher Chemical）、三氟乙酸（色谱级），氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为国药集团分析纯试剂。
对照品：标化研究后的rhLYZ对照品（批号201706006），以rhLYZ计5.892 mg·支-1，含量23.35%，辅料为氯化钠及磷酸钠。供试品：rhLYZ冻干粉原料3批，批号分别为：201706008、201706009、201706010，辅料为氯化钠及磷酸钠。
2 方法与结果 2.1 色谱条件流动相A为含0.1%三氟乙酸和0.9%氯化钠的水溶液；流动相B为含0.1%三氟乙酸和0.9%氯化钠水溶液-乙腈（40:60）流速：1.0 mL·min-1，检测波长280 nm，柱温：32 ℃；进样量：20 μL（定量环），52%B~67%B 30 min线性梯度洗脱，见表 1。
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表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program |
0.9%氯化钠超纯水溶液。
2.2.2 空白辅料溶液0.9%氯化钠，20 mmol·L-1pH 7.5磷酸钠缓冲液。
2.2.3 供试品溶液精密称量供试品201706010批干粉0.049 2 g，约含rhLYZ 15 mg，置于10 mL量瓶中，适量超纯水溶解，用稀释液定容至刻度，摇匀，即得。
2.2.4 对照品溶液精密称量对照品0.064 2 g，含rhLYZ 15.0 mg，置于10 mL量瓶中，适量超纯水溶解，用稀释液定容至刻度，摇匀，即得1.50 mg·mL-1对照品溶液。
2.3 专属性试验及结果① 对照品：取对照品溶液。②空白溶剂：取流动相A，“2.2.2”空白辅料溶液。③氧化破坏：次氯酸钠氧化产物制备：取对照品溶液1.0 mL，加入0.1%次氯酸钠溶液300 μL，室温氧化反应2 h，过滤，取滤过液即得；双氧水氧化产物制备：取对照品溶液1.0 mL，加入30%双氧水100 μL，室温氧化反应2 h，过滤，取滤过液即得。④高温破坏产物制备：取对照品溶液1.0 mL，100 ℃水浴30 min，室温放置1 h，过滤，取滤过液即得。⑤紫外线照射破坏产物制备：取对照品溶液1.0 mL，紫外灯下照射5 h，过滤，取滤过液即得。⑥盐酸水解产物制备：取对照品0.006 4 g，含rhLYZ 1.5 mg，加入1 mol·L-1盐酸100 μL浸润，室温酸水解2 h，1 mol·L-1氢氧化钠溶液100 μL中和，0.9%氯化钠溶液稀释至1.0 mL，过滤，取滤过液即得。⑦氢氧化钠水解产物制备：取对照品0.006 4 g，含rhLYZ 1.5 mg，加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液100 μL浸润，室温碱水解20 min，1 mol·L-1盐酸100 μL中和，0.9%氯化钠溶液稀释至1.0 mL，过滤，取滤过液即得。
将上述样品依“2.1”项下方法进行测定。结果表明本色谱条件下，rhLYZ保留时间约16 min；空白溶剂不干扰rhLYZ的含量测定；强碱中主成分全部被破坏，强酸水解在主峰后产生了一个破坏产物，加热及紫外照射对主成分均造成了较大破坏，产生了一系列杂峰，双氧水对rhLYZ影响较小，次氯酸钠氧化后在12.8和14.5 min有较大破坏产物，分离度为4.1、3.8，破坏产物和rhLYZ主峰可以完全分离，专属性良好。见图 1。
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A.对照品（reference standard）B.空白辅料溶液（blank excipient solution）C.次氯酸钠氧化（oxidation by sodium hypochlorite） 图 1 专属性验证色谱图 Figure 1 Chromatograms for specificity test |
取供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h取样，依“2.1”项下方法进行测定，计算rhLYZ峰面积的RSD为0.51%，主峰无明显降解。表明供试品溶液48 h内稳定。
2.5 精密度试验 2.5.1 重复性取供试品，按“2.2.3”项下方法制备样品6份，依“2.1”项下方法进行测定，计算rhLYZ平均含量分别为30.71%、30.74%、30.65%、30.65%、30.39%、30.46%，RSD为0.46%，重复性良好。
2.5.2 中间精密度取供试品，按“2.2.3”项下方法分3个工作日每日制备样品3份，依“2.1”项下方法进行测定，共9份验证数据，计算rhLYZ峰面积的RSD为0.52%，不同工作日间的中间精密度良好。
测定不同实验员间的变化，取供试品，按“2.2.3”项下方法3个实验员每人制备样品3份，依“2.1”项下方法进行测定，共9份验证数据，计算rhLYZ峰面积的RSD为0.53%，不同实验员间的中间精密度良好。
2.6 检测下限和定量下限试验取对照品，精密称量干粉0.032 1 g，含rhLYZ 7.50 mg，置于5.0 mL量瓶中，用稀释液溶解并定容至刻度。用10 mL量瓶，稀释液精密稀释制样，依“2.1”项下方法进行测定。本试验条件下基线噪音高度约为0.16 mV，当rhLYZ浓度为1.0×10-2 mg·mL-1，进样量20 μL，主峰高度为1.57 mV，信噪比约为10:1，定量限为200 ng；rhLYZ浓度为1.5×10-3 mg·mL-1，进样量20 μL，主峰高度为0.53 mV，信噪比约为3:1，检测限为30 ng。
2.7 线性关系和范围取对照品，精密称量干粉0.428 3 g（含rhLYZ 100.0 mg），置10 mL量瓶中，用稀释液溶解并定容至刻度，摇匀得质量浓度为10.00 mg·mL-1对照品储备液；再精密量取0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL，分别置于5 mL量瓶中，稀释液定容至刻度，摇匀，制成rhLYZ浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·mL-1的对照品溶液，依“2.1”项下方法进行测定，记录色谱图。以峰面积A对质量浓度C（mg·mL-1）作标准曲线，线性回归方程：
| $ C{\rm{ = 3}}{\rm{.514}} \times {10^{ - 7}}A + 1.095 \times {10^{ - 3}}\;\;r = 0.9999 $ |
在0.5~3.0 mg·mL-1范围内，rhLYZ质量浓度与峰面积线性关系良好。
2.8 准确度试验取201706010批供试品干粉约0.35 g，9份，精密称定，分别置于9个10 mL量瓶中，用稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，制成9份含rhLYZ约10 mg·mL-1的供试品储备液；精密称取对照品0.429 7 g（含rhLYZ 100.3 mg），置于10 mL量瓶中，用稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，制成10.03 mg·mL-1的对照品储备液。
从9份供试品储备液中各精密量取1.0 mL，置于9个10 mL量瓶中，稀释液定容至刻度，摇匀，制成用于测定9份供试品中rhLYZ含量的溶液；再从9份供试品储备液中各精密量取1.0 mL，置于9个10 mL量瓶中，从对照品储备液中分别精密量取1.5、1.0、0.5 mL各3份，分别加入上述9个10 mL量瓶中，稀释液定容至刻度，摇匀，制成对照品与供试品中rhLYZ的比例约为1.5:1、1:1、0.5:1的溶液各3份，按“2.1”项下方法进行测定，色谱峰面积用标准曲线计算，得各溶液中rhLYZ的量，求得平均回收率（n=9）为99.7%，RSD为0.94%。结果见表 2。
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表 2 回收率试验结果（n=9） Table 2 Recovery test result |
精密称量3批rhLYZ冻干粉适量，每批3份，置于10 mL量瓶中，用稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，依“2.1”项下方法进行测定，色谱峰面积用标准曲线计算得各样品中rhLYZ的含量，结果见表 3。
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表 3 3批rhLYZ含量检测结果（n=3） Table 3 The content test results of three batches of rhLYZ |
精密称量201706010批rhLYZ冻干粉7份，置于7个10 mL量瓶中，用稀释液溶解并定容至刻度，摇匀制成每1 mL含rhLYZ分别约为15、12、10、9、7.5、6、5 mg的样品溶液，依“2.1”项下条件进行测定，记录色谱图，计算各样品的理论板数，主峰与最近杂质的分离度，结果见表 4。从结果可以看出，供试品中rhLYZ最大进样浓度大于5 mg·mL-1的6个样品，进样量过大导致供试品色谱峰板数降低，主峰与最近杂质无法有效分离，影响了杂质的分离检测；供试品中rhLYZ进样浓度约为5 mg·mL-1时，理论板数为13 120，主峰与最近杂质的分离度为1.84，与其他杂质峰分离良好，同时可最大限度地使微量杂质准确积分。见图 2。
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表 4 系统适用性试验结果 Table 4 System suitability test results |
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1.主要杂质1（major impurity 1）2.杂质2（impurity 2）3.杂质3（impurity 3）4.杂质4（impurity 4）5.主要杂质5（major impurity 5）6.杂质6（impurity 6） A.供试品（sample）B. 1.5%的对照（1.5% reference substance）C. 2.0%的对照（2.0% reference substance） 图 2 典型杂质测定色谱图 Figure 2 Typical chromatograms for impurity determination |
精密量取“2.9.2.1”项下含rhLYZ约为5 mg·mL-1的供试品溶液1.5、2 mL，分别置于100 mL量瓶中，稀释液定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液的1.5%、2.0%浓度的溶液作为对照溶液，取供试品溶液和对照溶液，依“2.1”项下条件测定，每个样品测定6次，记录色谱图。供试品溶液中除主峰外共有6个杂质峰，见图 2。其中主要杂质1的峰面积RSD为2.4%，主要杂质5的峰面积RSD为3.9%，总杂质峰面积RSD为4.2%；1.5%对照溶液峰面积RSD为0.83%，2.0%对照溶液峰面积RSD为0.39%；RSD均小于5%。
2.9.2.3 杂质测定精密称量3批rhLYZ干粉适量，置于10 mL量瓶中，用稀释液溶解并定容至刻度，摇匀，作为杂质测定用供试品溶液。各精密量取1.5、2 mL，分别置于100 mL量瓶中，稀释液定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液的1.5%、2.0%浓度的溶液作为对照溶液，取对照溶液和杂质测定用供试品溶液，依“2.1”项下条件进行测定，每个样品测定3次，记录色谱图，供试品中主成分与杂质峰分离度大于1.5，主要杂质峰、总杂质峰及对照溶液峰面积RSD均小于5%，按不加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量，结果见表 5。3批rhLYZ冻干粉原料单杂均小于1.5%，总杂质均小于2%，纯度均大于98%。
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表 5 rhLYZ杂质测定结果（%） Table 5 Determination of impurities in rhLYZ |
在rhLYZ纯化及相关试验过程中，发现该蛋白为盐溶性蛋白，在100 mmol·L-1以上的氯化钠水溶液中溶解性良好，低于100 mmol·L-1的氯化钠水溶液中rhLYZ溶液会呈悬浊状态。常用的反相高效液相色谱的流动相中不添加氯化钠，导致分析过程中rhLYZ处于不完全溶解状态，色谱峰面积无法准确反映量效关系。
故对流动相进行了改进，在流动相中添加氯化钠，确保在反相高效液相色谱分析过程中rhLYZ的溶解性。在配制流动相B时先将氯化钠完全溶于超纯水中，再与乙腈混溶，避免氯化钠在乙腈中不溶，0.9%氯化钠水溶液与乙腈（40:60）的配比使流动相B溶解性良好，该配比同时满足本色谱条件下有机相的分析比例。
3.2 检测波长将重组人溶菌酶溶解在醋酸-醋酸钠缓冲液中，照分光光度法（《中华人民共和国药典》2015年版三部通则0401）测定，在280 nm的波长处有最大吸收。
3.3 专属性试验在色谱图中主峰前有一微量杂质，由于是重组生物产品，无法获得该杂质的单一组分。相关实验过程中发现，该杂质的产生可能与生产过程所用水中的微量次氯酸氧化有一定的关系，因此在专属性实验中，设计了用次氯酸钠氧化rhLYZ的试验，随着次氯酸钠加入量的逐渐加大，该杂质峰会逐渐变大，主峰含量逐渐降低，这一现象很好地验证了本检测方法的专属性。
3.4 杂质测定rhLYZ为重组生物制品，在反相色谱法中无法明确每一微量杂质具体为何种物质，故而无法获得各杂质的校正因子，因此在用反相高效液相色谱法测定杂质含量时，使用《中华人民共和国药典》2015年版色谱法中的不加校正因子的主成分自身对照法，计算杂质含量。
以此法测定供试品中杂质时，进样量应尽量大，使其中的微量杂质尽可能多地被检测出来，但同时进样量过大，主峰面积增大，理论板数降低，与杂质的分离度下降，也不利于杂质的测定，因此设计了最大进样量验证，在满足系统适用性的前提下，最大进样量以rhLYZ计约5 mg·mL-1。根据药典规定，运用此法时需对相应限度对照溶液的峰面积进行RSD的验证，含量在0.5%~2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%；本研究对不同限度对照溶液峰面积，供试品中主要杂质的峰面积，总杂质峰面积同时进行了验证，相应的RSD均小于5%，表明本法用于rhLYZ中杂质含量的测定可行。
3.5 小结本研究建立的反相高效液相色谱定量检测rhLYZ的方法，准确度好，精密度高，重复性稳定，可用于rhLYZ的纯度分析及定量检测，并为完善及提高rhLYZ原料及相关产品的质量标准提供了一定的实践基础和科学依据。
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