异氟烷(isoflurane,CF3CHCl-O-CHF2)化学名为2-氯-2(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷,其为恩氟烷异构体,是目前临床应用最广泛的吸入性全麻药[1],麻醉诱导和复苏均较快,麻醉时无交感神经系统兴奋现象,可使心脏对肾上腺素的作用稍有增敏,有一定的肌松作用。异氟烷用于全身麻醉的诱导和维持,也可酌情选用于分娩麻醉及颈部手术麻醉等[2-5]。异氟烷的合成工艺主要以三氟乙醇为原料,经醚化和氯化得到粗产品,再经精馏得到目标物,其合成及纯化过程中产生的副产物及残留的有机溶剂,均能影响药物的安全性。《中华人民共和国药典》2015年版[6]虽对异氟烷有关物质和残留溶剂进行了规定,但根据异氟烷的合成工艺及与国外药典[7-8]比较,发现现行质量标准[6]对有关物质和残留溶剂的规定存在:供试品浓度太低,杂质不易检出;杂质限度规定较高,且未定量单个杂质;残留溶剂的项目设置不合理等问题。目前文献报道主要以GC法测定异氟烷及其异构体的含量及有关物质[9-14],但均未对其有关物质和残留溶剂进行系统的分析控制,为了进一步完善生产工艺,控制产品质量,本文采用GC-FID方法同时对异氟烷有关物质和残留溶剂进行研究并建立测定方法。
1 仪器、试药与样品Agilent 7890N气相色谱仪(FID检测器),CTC自动进样器;梅特勒XS-205 du型电子天平。
对照品1-氯-2,2,2-三氟乙基氯二氟甲基醚(批号RO19EO)、2,2,2-三氟乙基二氟甲基醚(批号RO12KO)购自美国药典(USP);丙酮(批号9002-03,J.T.Baker)、N,N-二甲基甲酰胺(批号F1615168,阿拉丁)均为色谱纯;异氟烷样品为国家评价性抽验样品。
2 方法与结果 2.1 色谱条件及系统适用性试验以2-硝基对苯二酸改性的聚乙二醇(FFAP)(或极性相似)为固定液的毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);氢火焰离子化检测器(FID);载气为高纯氮气,流速为1 mL·min-1,分流比为10:1;程序升温(起始温度为55 ℃,维持7 min;以30 ℃·min-1的速率升温至210 ℃,维持15 min;以10 ℃·min-1的速率升温至240 ℃,维持3 min);进样口温度为150 ℃;检测器温度为250 ℃;进样体积为1 μL,理论板数按异氟烷峰计应不低于10 000,各峰间的分离度应符合规定。
2.2 溶液的制备 2.2.1 内标溶液精密称取乙酸丁酯约1.2 g,置100 mL量瓶中,用异氟烷稀释至刻度,摇匀,即得。
2.2.2 混合对照品溶液取本品(异氟烷)约90 mL,置100 mL量瓶中,精密加入1-氯-2,2,2-三氟乙基氯二氟甲基醚(异氟烷杂质A)100 μL、2,2,2-三氟乙基二氟甲基醚(异氟烷杂质B)72 μL、丙酮100 μL、N,N-二甲基甲酰胺50 μL,加本品(异氟烷)稀释至刻度,摇匀,作为混合对照品储备液。精密量取对照品储备液5 mL,内标溶液100 μL,置50 mL量瓶中,用本品(异氟烷)稀释至刻度,摇匀,即得。
2.2.3 供试品溶液取本品(异氟烷)约20 mL,置25 mL量瓶中,精密加入内标溶液50 μL,用本品(异氟烷)稀释至刻度,摇匀,即得。
2.3 测定法精密量取供试品溶液和对照品溶液各1 μL,分别注入气相色谱仪,GC图谱见图 1,按下列公式计算已知杂质和未知杂质含量。
$ 已知杂质计算公式 = P \times \frac{{{R_{\rm{u}}}}}{{{R_{\rm{s}}} - {R_{\rm{u}}}}} $ |
其中P为对照品溶液中已知杂质的百分含量,Ru及Rs分别为供试品溶液和对照品溶液中已知杂质的峰面积与内标峰面积的比值。
$ 未知杂质计算公式 = P \times \frac{{{R_{\rm{i}}}}}{{{R_{\rm{s}}} - {R_{\rm{i}}}}} $ |
其中P为对照品溶液中异氟烷杂质B的百分含量,Ri为供试品溶液中未知杂质峰面积与内标峰面积的比值,Rs为对照品溶液中异氟烷杂质B的峰面积与内标峰面积的比值。
含异氟烷杂质A和丙酮不得过0.01%(v/v);含异氟烷杂质B不得过0.007%(v/v);含N,N-二甲基甲酰胺不得过0.002%(v/v);含其他单个未知杂质以异氟烷杂质B计算不得过0.003%(v/v),各杂质的和不得过0.1%。
2.4 线性关系考察取“2.2.2”项下的混合对照品储备液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置10 mL量瓶中,分别精密加内标溶液20 μL,用异氟烷稀释至刻度,摇匀,按上述色谱条件测定,以校正因子(A内标/A样品,A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,分别得到异氟烷杂质A、杂质B、丙酮和N,N-二甲基甲酰胺回归方程:
$ \begin{array}{l} A = 0.117\;C - 0.006\;\;\;{r^2} = 0.994\\ A = 0.247\;C - 0.006\;\;\;{r^2} = 0.995\\ A = 0.042\;C - 0.006\;\;\;{r^2} = 0.993\\ A = 0.044\;C\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;{r^2} = 0.992 \end{array} $ |
质量浓度分别在0.02~0.20、0.014 4~0.144、0.02~0.20、0.002~0.02 μL·mL-1范围内有良好的线性关系。
2.5 加样回收率试验精密量取已知杂质含量的异氟烷样品(批号64160301,鲁南贝特制药有限公司)适量,共9份,分别置10 mL量瓶中,加混合对照品储备液0.8、1.0、1.2 mL各3份,再分别加内标溶液20 μL,用异氟烷稀释至刻度,摇匀,即得加样回收供试液,按上述色谱条件测定,计算回收率,结果见表 1。
精密吸取混合对照品溶液1 μL,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,结果异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、丙酮和N,N-二甲基甲酰胺峰面积与相应内标峰面积比值的RSD分别为1.2%、1.1%、1.0%和1.9%。表明精密度良好。
2.7 稳定性试验精密量取混合对照品溶液,分别于0、4、8、12、16、20、24 h进样测定,记录异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、丙酮和N,N-二甲基甲酰胺峰面积与相应内标峰面积比值的RSD分别为1.0%、1.2%、1.5%、1.8%,表明混合对照品溶液在24 h内稳定。
2.8 检测下限和定量下限精密量取“2.2.2”项下的混合对照品溶液,用异氟烷定量稀释成适宜浓度的溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,以信噪比S/N为3和10时,确定为检测下限和定量下限。结果测得异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、丙酮,N,N-二甲基甲酰胺检测下限分别为0.003、0.006、1.1、0.76 μg·mL-1;定量下限分别为0.012、0.022、3.1、1.9 μg·mL-1。
2.9 专属性试验取本品5 mL 3份,分别置25 mL量瓶中,分别加入2 mol·L-1的盐酸溶液2.5 mL(振摇5 h,再加2 mol·L-1的氢氧化钠溶液2.5 mL中和),2 mol·L-1的氢氧化钠溶液(振摇5 h,再加2 mol·L-1的盐酸溶液2.5 mL中和),30%的过氧化氢溶液5 mL(振摇5 h),摇匀,滤过,取续滤液1 μL进样测定,结果表明,本品在强酸、强碱和氧化破坏等环境中均较稳定,无明显降解杂质产生。
2.10 校正因子测定取对照品溶液1 μL,连续进样6次,按《中华人民共和国药典》2015年版四部通则的方法[15]计算平均校正因子及RSD,结果异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、丙酮和N,N-二甲基甲酰胺的平均校正因子分别为3.838 94、11.219 21、1.366 33、7.163 52,RSD分别为1.2%、1.1%、0.95%、1.9%。
2.11 样品测定取3个厂家的7批异氟烷样品,按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液,按照拟定的方法测定有关物质,计算已知杂质和未知杂质含量,结果见表 2。
《中华人民共和国药典》2015年版“有关物质”规定“按面积归一化法计算,各杂质峰面积和不得大于总峰面积的0.5%”,但异氟烷杂质A、杂质B均为异氟烷合成过程产生的杂质,建议对其进行定量控制;“残留溶剂”项下规定了“丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮” 3种可能的残留溶剂。通过该药品的合成工艺可知,3个厂家在最后的精馏步骤中用到了丙酮和N,N-二甲基甲酰胺2种溶剂,而N-甲基吡咯烷酮为第1步醚化反应中用到的溶剂,该溶剂应该在产品合成的中间过程加以控制;且按照建立的方法对7批样品测定也均未检测到N-甲基吡咯烷酮,所以新拟定的质量标准只对异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、丙酮和N,N-二甲基甲酰胺4种已知杂质和残留溶剂定量控制,其他未知杂质通过异氟烷杂质B定量计算控制。USP39版规定的杂质C、D、E由于对照品的制备较难,且其限度规定同未知杂质限度0.003%,所以拟定的标准对其控制建议按未知杂质定量控制。
3.2 杂质限度的规定根据ICH[16]危害程度对残留溶剂允许日接触量(PDE)的规定,丙酮的PDE为50 mg·d-1,N,N-二甲基甲酰胺的PDE为8.8 mg·d-1;通过医院的麻醉师了解到,异氟烷的用法用量普通人大约为10 mL·h-1,异氟烷的密度约为1.5,1 d最大剂量按24 h计算,其每天最大吸入剂量约为360 g,据残留溶剂的浓度限度计算公式,确定N,N-二甲基甲酰胺的限度。丙酮、异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、其他未知杂质及总杂质的限度同USP 39版异氟烷“有关物质”项下的规定。
$ 浓度限度 = \frac{{{\rm{PDE}}\left( {{\rm{mg}} \cdot {{\rm{d}}^{ - 1}}} \right)}}{{剂量\left( {{\rm{g}} \cdot {{\rm{d}}^{ - 1}}} \right)}} \times 1000 $ |
为了确保主成分与各杂质较好地分离,对色谱条件中的升温程序、流速、分流比等进行了不同组合的对比和尝试,最终确定分离效果最好的上述色谱条件。
3.4 色谱柱的确定通过筛选不同的色谱柱,比较了DB-624、DB-WAX、FFAP等极性相似的色谱柱,最终选择FFAP色谱柱,其对异氟烷、各杂质和内标乙酸丁酯均有较好的分离和响应。
3.5 溶剂的确定实验中考察了不同品牌、不同级别的正己烷和环己烷作为溶液制备用溶剂,但实验发现各种溶剂在确定的色谱条件下均有不同响应的杂质峰,影响混合对照品中各杂质的分离,本文参考USP 39版溶液的制备和测定方法,选用异氟烷样品作为溶剂制备对照品溶液,通过计算公式(详见“2.3”)消除样品自身的杂质影响。
3.6 与现行质量标准测定结果的比较用新拟定的质量标准草案对全部样品的杂质和残留溶剂进行检测,检出率和检出量较法定质量标准均有提高,由表 2可知,7批样品中有3批不合格,2批为未知杂质超出限度(0.003%),1批为杂质A超出限度范围(0.01%),但按照法定质量标准检验,均符合规定,以上结果说明异氟烷现行质量标准有待提高,新建立的质量标准能较好地控制异氟烷的生产工艺和质量。
[1] |
HUGCC Jr, 丁强. 有关麻醉剂的新见解[J]. 国外医学.外科学分册, 1989(4): 223. HUG CC Jr, DING Q. New insights on anesthesia[J]. Foreign Med Sci Surg Sect, 1989(4): 223. |
[2] |
陈祥东. 吸入麻醉剂异氟醚与围麻醉期间对心肌冠状血流的影响[J]. 中国临床医学研究, 2004, 2(9): 76. CHEN XD. The effect of inhalation of anesthetic isofluoroether and pericardial coronary blood flow during perianesthesia[J]. Chin J Clin Med, 2004, 2(9): 76. |
[3] |
李泉, 李大勇, 冉大强, 等. 异氟烷综述[J]. 山东医药工业, 2002, 21(1): 32. LI Q, LI DY, RAN DQ, et al. Review of isoflurane[J]. Pharm Ind Shandong, 2002, 21(1): 32. DOI:10.3969/j.issn.1672-7738.2002.01.031 |
[4] |
ROSS CT, LOUISE S, ALEX JS. General anesthetics 1:fluorinated methyl cthyl ethers as anestheticagents[J]. J Med Chem, 1971, 14(6): 517. DOI:10.1021/jm00288a014 |
[5] |
YU BW, XUE QS, LU Y. Research progress of inhalation anesthetic[J]. Contin Med Educ, 2006, 20(15): 26. |
[6] |
中华人民共和国药典2015年版.二部[S]. 2015: 411 ChP 2015.Vol Ⅱ[S].2015: 411 |
[7] |
USP 39-NF 34[S]. 2015: 4403
|
[8] |
EP 8.0[S]. 2013: 2532
|
[9] |
张勇, 钱广生, 刘三康, 等. 大口径毛细管气相色谱法测定异氟烷注射液含量及有关物质[J]. 四川大学学报(医学版), 2006, 37(1): 153. ZHANG Y, QIAN GS, LIU SK, et al. Determine ation of content and related substances of in isoflurane by the large-caliber capillary gas chromatography[J]. J Sichuan Univ (Med Sci Ed), 2006, 37(1): 153. |
[10] |
史晶, 张莹莹, 武传飞. 毛细管气相色谱法测定七氟烷中的有关物质和含量[J]. 山东化工, 2015, 44(16): 93. SHI J, ZHANG YY, WU ZF. Determination of related substances and assay of sevoflurane by capillary gas chromatography[J]. Shandong Chem Ind, 2015, 44(16): 93. DOI:10.3969/j.issn.1008-021X.2015.16.034 |
[11] |
刘兰侠, 杨龙彪, 倪蓉, 等. 毛细管气相色谱法测定七氟烷含量[J]. 中国卫生检验杂志, 2011, 21(5): 1116. LIU LX, YANG LB, NI R, et al. Determination of sevoflurane by capillary gas chromatography[J]. Chin J Health Lab Technol, 2011, 21(5): 1116. |
[12] |
刘明洁, 胡德福. 气相色谱法测定异氟烷含量[J]. 药物分析杂志, 1998, 18(3): 196. LIU MJ, HU DF. Determination of related substances in isoflurane by GC[J]. Chin J Pharm Anal, 1998, 18(3): 196. |
[13] |
王悦, 刘舒扬, 李银峰, 等. 毛细管柱气相色谱法测定七氟烷的有关物质[J]. 中国医药导报, 2012, 9(5): 119. WANG Y, LIU SY, LI YF, et al. Determination of related substances of sevoflurane by capillary gas chromatography[J]. China Med Her, 2012, 9(5): 119. DOI:10.3969/j.issn.1673-7210.2012.05.053 |
[14] |
李宝林, 李迅, 张国军, 等. 异氟烷的质量研究[J]. 中国药学杂志, 1999, 34(12): 841. LI BL, LI X, ZHANG GJ, et al. Quality control of isoflurane[J]. Chin Pharm J, 1999, 34(12): 841. |
[15] |
中华人民共和国药典2015年版.四部[S]. 2015: 60 ChP 2015.Vol Ⅳ[S].2015: 60 |
[16] |
ICH Harmonised Tripartite Guideline: Impurities in New Drug Product, Q3B(R2)[S]. 2006
|