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  药物分析杂志   2018, Vol. 38 Issue (12): 2116-2121.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.12.09
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马玲, 陈欢, 黄钰馨, 沈晓华, 刘瑞, 撖志明, 刘加. 异氟烷有关物质和残留溶剂的测定[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(12): 2116-2121. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.12.09.
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MA Ling, CHEN Huan, HUANG Yu-xin, SHEN Xiao-hua, LIU Rui, HAN Zhi-ming, LIU Jia. Determination of related substances and residual solvents in isoflurane[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2018, 38(12): 2116-2121. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.12.09.
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第一作者

马玲, Tel:(0951)4104813;E-mail:maling120@163.com

文章历史

修改日期:2018-09-20
异氟烷有关物质和残留溶剂的测定
马玲 , 陈欢 , 黄钰馨 , 沈晓华 , 刘瑞 , 撖志明 , 刘加     
宁夏回族自治区药品检验研究院, 银川 750001
摘要目的:完善和建立异氟烷有关物质和残留溶剂的测定方法。方法:采用2-硝基对苯二酸改性的聚乙二醇(FFAP)(或极性相似)为固定液的毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);氢火焰离子化检测器;载气为氮气,流速为1 mL·min-1,分流比为10:1,程序升温(起始温度为55℃,维持7 min;以30℃ min-1的速率升温至210℃,维持15 min;以10℃ min-1的速率升温至240℃,维持3 min);进样口温度为150℃;检测器温度为250℃。结果:1-氯-2,2,2-三氟乙基氯二氟甲基醚(异氟烷杂质A)、2,2,2-三氟乙基二氟甲基醚(异氟烷杂质B)、丙酮、NN-二甲基甲酰胺分别在0.02~0.2、0.0 144~0.144、0.02~0.2、0.002~0.02 μL·mL-1范围内呈良好的线性关系,平均回收率分别为101.7%、101.6%、99.0%、97.6%,RSD分别为3.0%、2.5%、2.1%、2.3%,检测下限分别为0.003、0.006 48、1.099 9、0.758 4 μg·mL-1结论:建立的方法可用于异氟烷有关物质和残留溶剂的测定,能更有效地控制异氟烷的质量。
关键词异氟烷    有关物质    残留溶剂    毛细管气相色谱法    标准提高。    
Determination of related substances and residual solvents in isoflurane
MA Ling, CHEN Huan, HUANG Yu-xin, SHEN Xiao-hua, LIU Rui, HAN Zhi-ming, LIU Jia    
Ningxia Institute of Drug Control, Yinchuan 750001, China
Abstract: Objective: To establish a method for the determination of related substances and residual solvents in isoflurane.Methods: The residual organic solvents were determined by GC with capillary column(FFAP), FID detector and nitrogen as carrier gas.The temperature of the injection port was 150℃ and the detector temperature was 250℃.The initial column temperature was 55℃, maintaining 7 min, and the temperature was raised to 210℃ at a rate of 30℃·min-1, maintaining 15 min.The temperature was raised to 240℃ at a rate of 10℃·min-1, maintaining 3 min.The flow rate of N2 was 1.0 mL·min-1.Results: The calibration curve showed a good linearity with the range of 0.02-0.2 μL·mL-1 for isoflurane related compound A(r2=0.994), with the range of 0.0 144-0.144 μL·mL-1 for isoflurane related compound B(r2=0.995), with the range of 0.02-0.2 μL·mL-1 for acetone(r2=0.993) and with the range of 0.002-0.02 μL·mL-1 for N, N-dimethyl formamide(r2=0.992).The average recoveries(n=9) of isoflurane related compound A, isoflurane related compound B, acetone and N, N-dimethyl formamide were 101.7%(RSD=3.0%), 101.6%(RSD=2.5%), 99.0%(RSD=2.1%) and 97.6%(RSD=2.3%).The detection limits of isoflurane related compound A, isoflurane related compound B, acetone and N, N-dimethyl formamide were 0.003 μg·mL-1, 0.006 48 μg·mL-1, 1.099 9 μg·mL-1 and 0.758 4 μg·mL-1.Conclusion: This method is accurate, reliable and sensitive for the determination of related substances and residual solvents in isoflurane.
Key words: isoflurane    related substances    residual solvents    capillary gas chromatography    standard improvement    

异氟烷(isoflurane,CF3CHCl-O-CHF2)化学名为2-氯-2(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟乙烷,其为恩氟烷异构体,是目前临床应用最广泛的吸入性全麻药[1],麻醉诱导和复苏均较快,麻醉时无交感神经系统兴奋现象,可使心脏对肾上腺素的作用稍有增敏,有一定的肌松作用。异氟烷用于全身麻醉的诱导和维持,也可酌情选用于分娩麻醉及颈部手术麻醉等[2-5]。异氟烷的合成工艺主要以三氟乙醇为原料,经醚化和氯化得到粗产品,再经精馏得到目标物,其合成及纯化过程中产生的副产物及残留的有机溶剂,均能影响药物的安全性。《中华人民共和国药典》2015年版[6]虽对异氟烷有关物质和残留溶剂进行了规定,但根据异氟烷的合成工艺及与国外药典[7-8]比较,发现现行质量标准[6]对有关物质和残留溶剂的规定存在:供试品浓度太低,杂质不易检出;杂质限度规定较高,且未定量单个杂质;残留溶剂的项目设置不合理等问题。目前文献报道主要以GC法测定异氟烷及其异构体的含量及有关物质[9-14],但均未对其有关物质和残留溶剂进行系统的分析控制,为了进一步完善生产工艺,控制产品质量,本文采用GC-FID方法同时对异氟烷有关物质和残留溶剂进行研究并建立测定方法。

1 仪器、试药与样品

Agilent 7890N气相色谱仪(FID检测器),CTC自动进样器;梅特勒XS-205 du型电子天平。

对照品1-氯-2,2,2-三氟乙基氯二氟甲基醚(批号RO19EO)、2,2,2-三氟乙基二氟甲基醚(批号RO12KO)购自美国药典(USP);丙酮(批号9002-03,J.T.Baker)、NN-二甲基甲酰胺(批号F1615168,阿拉丁)均为色谱纯;异氟烷样品为国家评价性抽验样品。

2 方法与结果 2.1 色谱条件及系统适用性试验

以2-硝基对苯二酸改性的聚乙二醇(FFAP)(或极性相似)为固定液的毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);氢火焰离子化检测器(FID);载气为高纯氮气,流速为1 mL·min-1,分流比为10:1;程序升温(起始温度为55 ℃,维持7 min;以30 ℃·min-1的速率升温至210 ℃,维持15 min;以10 ℃·min-1的速率升温至240 ℃,维持3 min);进样口温度为150 ℃;检测器温度为250 ℃;进样体积为1 μL,理论板数按异氟烷峰计应不低于10 000,各峰间的分离度应符合规定。

2.2 溶液的制备 2.2.1 内标溶液

精密称取乙酸丁酯约1.2 g,置100 mL量瓶中,用异氟烷稀释至刻度,摇匀,即得。

2.2.2 混合对照品溶液

取本品(异氟烷)约90 mL,置100 mL量瓶中,精密加入1-氯-2,2,2-三氟乙基氯二氟甲基醚(异氟烷杂质A)100 μL、2,2,2-三氟乙基二氟甲基醚(异氟烷杂质B)72 μL、丙酮100 μL、NN-二甲基甲酰胺50 μL,加本品(异氟烷)稀释至刻度,摇匀,作为混合对照品储备液。精密量取对照品储备液5 mL,内标溶液100 μL,置50 mL量瓶中,用本品(异氟烷)稀释至刻度,摇匀,即得。

2.2.3 供试品溶液

取本品(异氟烷)约20 mL,置25 mL量瓶中,精密加入内标溶液50 μL,用本品(异氟烷)稀释至刻度,摇匀,即得。

2.3 测定法

精密量取供试品溶液和对照品溶液各1 μL,分别注入气相色谱仪,GC图谱见图 1,按下列公式计算已知杂质和未知杂质含量。

$ 已知杂质计算公式 = P \times \frac{{{R_{\rm{u}}}}}{{{R_{\rm{s}}} - {R_{\rm{u}}}}} $
1.异氟烷杂质A(isoflurane related compound A)2.异氟烷杂质B(isoflurane related compound B)3.丙酮(acetone)4.异氟烷(isoflurane)5.乙酸丁酯(butyl acetate)6. NN-二甲基甲酰胺(NN-dimethyl formamide) 图 1 对照品(A)及样品(B)气相色谱图 Figure 1 GC chromatograms of reference substances (A)and sample(B)

其中P为对照品溶液中已知杂质的百分含量,RuRs分别为供试品溶液和对照品溶液中已知杂质的峰面积与内标峰面积的比值。

$ 未知杂质计算公式 = P \times \frac{{{R_{\rm{i}}}}}{{{R_{\rm{s}}} - {R_{\rm{i}}}}} $

其中P为对照品溶液中异氟烷杂质B的百分含量,Ri为供试品溶液中未知杂质峰面积与内标峰面积的比值,Rs为对照品溶液中异氟烷杂质B的峰面积与内标峰面积的比值。

含异氟烷杂质A和丙酮不得过0.01%(v/v);含异氟烷杂质B不得过0.007%(v/v);含NN-二甲基甲酰胺不得过0.002%(v/v);含其他单个未知杂质以异氟烷杂质B计算不得过0.003%(v/v),各杂质的和不得过0.1%。

2.4 线性关系考察

取“2.2.2”项下的混合对照品储备液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置10 mL量瓶中,分别精密加内标溶液20 μL,用异氟烷稀释至刻度,摇匀,按上述色谱条件测定,以校正因子(A内标/A样品A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线,分别得到异氟烷杂质A、杂质B、丙酮和NN-二甲基甲酰胺回归方程:

$ \begin{array}{l} A = 0.117\;C - 0.006\;\;\;{r^2} = 0.994\\ A = 0.247\;C - 0.006\;\;\;{r^2} = 0.995\\ A = 0.042\;C - 0.006\;\;\;{r^2} = 0.993\\ A = 0.044\;C\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;\;{r^2} = 0.992 \end{array} $

质量浓度分别在0.02~0.20、0.014 4~0.144、0.02~0.20、0.002~0.02 μL·mL-1范围内有良好的线性关系。

2.5 加样回收率试验

精密量取已知杂质含量的异氟烷样品(批号64160301,鲁南贝特制药有限公司)适量,共9份,分别置10 mL量瓶中,加混合对照品储备液0.8、1.0、1.2 mL各3份,再分别加内标溶液20 μL,用异氟烷稀释至刻度,摇匀,即得加样回收供试液,按上述色谱条件测定,计算回收率,结果见表 1

表 1 回收率实验结果 Table 1 Results of recovery tests
2.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液1 μL,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,结果异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、丙酮和NN-二甲基甲酰胺峰面积与相应内标峰面积比值的RSD分别为1.2%、1.1%、1.0%和1.9%。表明精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密量取混合对照品溶液,分别于0、4、8、12、16、20、24 h进样测定,记录异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、丙酮和NN-二甲基甲酰胺峰面积与相应内标峰面积比值的RSD分别为1.0%、1.2%、1.5%、1.8%,表明混合对照品溶液在24 h内稳定。

2.8 检测下限和定量下限

精密量取“2.2.2”项下的混合对照品溶液,用异氟烷定量稀释成适宜浓度的溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,以信噪比S/N为3和10时,确定为检测下限和定量下限。结果测得异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、丙酮,NN-二甲基甲酰胺检测下限分别为0.003、0.006、1.1、0.76 μg·mL-1;定量下限分别为0.012、0.022、3.1、1.9 μg·mL-1

2.9 专属性试验

取本品5 mL 3份,分别置25 mL量瓶中,分别加入2 mol·L-1的盐酸溶液2.5 mL(振摇5 h,再加2 mol·L-1的氢氧化钠溶液2.5 mL中和),2 mol·L-1的氢氧化钠溶液(振摇5 h,再加2 mol·L-1的盐酸溶液2.5 mL中和),30%的过氧化氢溶液5 mL(振摇5 h),摇匀,滤过,取续滤液1 μL进样测定,结果表明,本品在强酸、强碱和氧化破坏等环境中均较稳定,无明显降解杂质产生。

2.10 校正因子测定

取对照品溶液1 μL,连续进样6次,按《中华人民共和国药典》2015年版四部通则的方法[15]计算平均校正因子及RSD,结果异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、丙酮和NN-二甲基甲酰胺的平均校正因子分别为3.838 94、11.219 21、1.366 33、7.163 52,RSD分别为1.2%、1.1%、0.95%、1.9%。

2.11 样品测定

取3个厂家的7批异氟烷样品,按“2.2.3”项下的方法制备供试品溶液,按照拟定的方法测定有关物质,计算已知杂质和未知杂质含量,结果见表 2

表 2 有关物质测定结果(%) Table 2 Determination of the related substances
3 讨论 3.1 杂质的规定

《中华人民共和国药典》2015年版“有关物质”规定“按面积归一化法计算,各杂质峰面积和不得大于总峰面积的0.5%”,但异氟烷杂质A、杂质B均为异氟烷合成过程产生的杂质,建议对其进行定量控制;“残留溶剂”项下规定了“丙酮、NN-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮” 3种可能的残留溶剂。通过该药品的合成工艺可知,3个厂家在最后的精馏步骤中用到了丙酮和NN-二甲基甲酰胺2种溶剂,而N-甲基吡咯烷酮为第1步醚化反应中用到的溶剂,该溶剂应该在产品合成的中间过程加以控制;且按照建立的方法对7批样品测定也均未检测到N-甲基吡咯烷酮,所以新拟定的质量标准只对异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、丙酮和NN-二甲基甲酰胺4种已知杂质和残留溶剂定量控制,其他未知杂质通过异氟烷杂质B定量计算控制。USP39版规定的杂质C、D、E由于对照品的制备较难,且其限度规定同未知杂质限度0.003%,所以拟定的标准对其控制建议按未知杂质定量控制。

3.2 杂质限度的规定

根据ICH[16]危害程度对残留溶剂允许日接触量(PDE)的规定,丙酮的PDE为50 mg·d-1NN-二甲基甲酰胺的PDE为8.8 mg·d-1;通过医院的麻醉师了解到,异氟烷的用法用量普通人大约为10 mL·h-1,异氟烷的密度约为1.5,1 d最大剂量按24 h计算,其每天最大吸入剂量约为360 g,据残留溶剂的浓度限度计算公式,确定NN-二甲基甲酰胺的限度。丙酮、异氟烷杂质A、异氟烷杂质B、其他未知杂质及总杂质的限度同USP 39版异氟烷“有关物质”项下的规定。

$ 浓度限度 = \frac{{{\rm{PDE}}\left( {{\rm{mg}} \cdot {{\rm{d}}^{ - 1}}} \right)}}{{剂量\left( {{\rm{g}} \cdot {{\rm{d}}^{ - 1}}} \right)}} \times 1000 $
3.3 色谱条件的确定

为了确保主成分与各杂质较好地分离,对色谱条件中的升温程序、流速、分流比等进行了不同组合的对比和尝试,最终确定分离效果最好的上述色谱条件。

3.4 色谱柱的确定

通过筛选不同的色谱柱,比较了DB-624、DB-WAX、FFAP等极性相似的色谱柱,最终选择FFAP色谱柱,其对异氟烷、各杂质和内标乙酸丁酯均有较好的分离和响应。

3.5 溶剂的确定

实验中考察了不同品牌、不同级别的正己烷和环己烷作为溶液制备用溶剂,但实验发现各种溶剂在确定的色谱条件下均有不同响应的杂质峰,影响混合对照品中各杂质的分离,本文参考USP 39版溶液的制备和测定方法,选用异氟烷样品作为溶剂制备对照品溶液,通过计算公式(详见“2.3”)消除样品自身的杂质影响。

3.6 与现行质量标准测定结果的比较

用新拟定的质量标准草案对全部样品的杂质和残留溶剂进行检测,检出率和检出量较法定质量标准均有提高,由表 2可知,7批样品中有3批不合格,2批为未知杂质超出限度(0.003%),1批为杂质A超出限度范围(0.01%),但按照法定质量标准检验,均符合规定,以上结果说明异氟烷现行质量标准有待提高,新建立的质量标准能较好地控制异氟烷的生产工艺和质量。

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