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  药物分析杂志   2018, Vol. 38 Issue (12): 2093-2103.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.12.06
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肖凌, 陈莹, 张飞, 龙小艳, 聂晶, 黄志军. 翠云草双黄酮类化学成分研究[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(12): 2093-2103. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.12.06.
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XIAO Ling, CHEN Ying, ZHANG Fei, LONG Xiao-yan, NIE Jing, HUANG Zhi-jun. Chemical constituents of biflavonoids from Selaginella uncinata[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2018, 38(12): 2093-2103. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.12.06.
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基金项目

国家药典委员会药品医疗器械审评审批制度改革子课题(中药)“中药材及饮片中重金属及有害元素限量标准研究——花叶全草类中药材”项目编号:ZG2016-1;国家食药监总局药化注册司项目“12种特色民族药材检验方法的示范性研究”

第一作者

肖凌, Tel:(027)87705271;E-mail:lingyun724@126.com

通信作者

聂晶, Tel:(027)87705232;E-mail:niejingwh@sina.com

文章历史

修改日期:2018-07-23
翠云草双黄酮类化学成分研究
肖凌 1, 陈莹 1,2, 张飞 1, 龙小艳 1,2, 聂晶 1, 黄志军 2    
1. 湖北省药品监督检验研究院, 武汉 430075;
2. 武汉理工大学, 武汉 430070
摘要目的:为全面分析翠云草双黄酮类化学成分,制订翠云草整体质量评价提供依据。方法:采用提取分离结合波谱学分析技术,分离鉴定单体双黄酮类化合物;采用LC-UV-MS技术,研究翠云草中已知化合物的质谱裂解规律,推测其他成分。结果:从翠云草中分离得到4个单体双黄酮类化合物,分别为罗波斯塔双黄酮-4'-甲醚(1)、2,3,2″,3″-四氢穗花杉双黄酮(2)、2,3-二氢穗花杉双黄酮(3)、2,3-二氢穗花杉双黄酮-4'-甲醚(4);归属了翠云草中14个特征成分峰,其中穗花杉双黄酮母核8个、罗波斯塔双黄酮母核5个、4'-O-6″-双苯醚母核1个。结论:本研究为翠云草指纹图谱分析、双黄酮类成分含量测定提供了依据,且为制订翠云草质量标准提供了对照物质。
关键词翠云草    双黄酮    化学成分    提取分离    液质联用    
Chemical constituents of biflavonoids from Selaginella uncinata
XIAO Ling1, CHEN Ying1,2, ZHANG Fei1, LONG Xiao-yan1,2, NIE Jing1, HUANG Zhi-jun2    
1. Hubei Provincial Institute for Drug Control, Wuhan 430075, China;
2. Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China
Abstract: Objective: Comprehensive analysis of biflavonoids from Selaginella uncinata was conducted and the results could offer material basis for its holistic quality evaluation.Methods: The monomer compounds were isolated and identified by means of chromatographic separation and spectrum analysis. LC-UV-MS was used to investigate the mass fragmentation rules of known compounds, then to conjecture others.Results: Four biflavonoids, robustaflavone-4'-methyl ether (1), 2, 3, 2″, 3″-tetrahydroamentoflavone (2), 2, 3-dihydroamentoflavone (3), 2, 3-dihydroamentoflavone-4'-methyl ether (4), were isolated from Selaginella uncinata. Fourteen biflavonoids were speculated, including three types of mother nucleus structures, eight amentoflavone, five robustaflavone and one hinokiflavone.Conclusion: This study could provide the foundation for the fingerprint and assay of biflavonoids of Selaginella uncinata. On the other hand, the results could offer the standard materials to draw up its quality standard.
Key words: Selaginella uncinata    biflavonoids    chemical constituents    extraction and separation    LC-MS    

翠云草Selaginella uncinata(Desv.)Spring为卷柏科卷柏属多年生草本植物,具有清热解毒、凉血止血等功效,用于治疗肺热咳嗽、黄疸、痢疾、咽喉肿痛、跌打损伤、多种出血等病症[1-3]。主要分布于广西、贵州、四川、湖北、湖南等地,目前收载于湖北、广东、广西等地方中药材质量标准。

据文献报道,卷柏属植物中主要化学成分为黄酮类化合物,以芹菜素及其衍生物为基本母核,如穗花衫双黄酮、异柳杉双黄酮、扁柏双黄酮、苏铁双黄酮及芹菜素等。通过C-C或者C-O-C连接而成,按照母核连接方式可分为3种类型[4]:3′,8″-双芹菜素型(即amentoflavone型)(A型)、3′,6″-双芹菜素型(即robustaflavone型)(B型)及4′-O-6″双苯醚型(即hinokiflavone型)(C型)。翠云草据报道含有多种双黄酮类成分[5-12],结构以穗花杉双黄酮与罗波斯塔双黄酮母核为主,包括氢化母核、甲氧基取代等多种类型。

本文首先采用提取分离结合谱学分析技术,从翠云草中分离得到4个单体双黄酮类化合物;再采用LC-UV-MS技术,研究翠云草中已知化合物的质谱裂解规律,推测出其他成分,共归属14个成分峰;分析翠云草中双黄酮化合物的结构特点,为整体评价翠云草质量提供依据。

1 仪器与材料

BUCHI公司B-540型BUCHI熔点测定仪;Bruker公司AV-500核磁共振仪;Waters ACQUITY UPLCXevo G2-Q-TOF液质联用色谱仪;安捷伦公司1200高效液相色谱仪DAD检测器;薄层色谱硅胶及柱色谱硅胶(青岛海洋化工有限公司)。ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);Mettler XP-204电子天平。纯净水为Milli-Q超纯水,其余试剂均为分析纯。

穗花杉双黄酮对照品含量90.2%,(批号111902-201102)购于中国食品药品检定研究院;白果黄素(含量 > 98%)购于天津一方科技有限公司。

样品于2016年9月采自湖北宜昌车溪,由中南民族大学万定荣教授鉴定为卷柏科植物翠云草Selaginella uncinata(Desv.)Spring的干燥全草。

2 方法与结果 2.1 提取与分离

取翠云草5 kg,加10倍量的95%乙醇水加热回流提取2次,每次1 h,合并提取液,减压浓缩至无醇味,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,减压回收溶剂,干燥,得乙酸乙酯部位60 g。取乙酸乙酯部位60 g,以三氯甲烷-甲醇(1:1)超声(功率160 W,频率30 kHz)处理30 min使溶解,上硅胶柱(200~300目),用三氯甲烷-甲醇(80:1→5:1)梯度洗脱,经色谱分析得到目标成分的组分,经半制备HPLC(250 mm×20 mm,5 μm)精制,乙腈-水(40:60)为流动相洗脱,继而重结晶精制,分别得到化合物1(65 mg)、2(10 mg)、3(10 mg)、4(10 mg)。

2.2 LC-MS方法 2.2.1 液相色谱条件

色谱柱:ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);流动相:以乙腈为流动相A、以水(含0.1%甲酸)为流动相B,流速0.2 ml·min-1,进行梯度洗脱(0~40 min,35%B→60%B,40~42 min,60%B→90%B,42~45 min,90%B→35%B,45~52 min,35%B);DAD检测波长:270 nm;柱温:30 ℃;进样量:1 μL。

2.2.2 质谱条件

电喷雾负离子模式(ESI-)检测;毛细管电压2. 8 kV;锥孔电压20 V;离子源温度100 ℃;洗脱溶剂温度300 ℃;脱溶剂气流量350 L·h-1,锥孔反吹气50 L·h-1。采集:采集方法是MSE,采集时间52 min。扫描范围m/z 100~1 500。碰撞能量:低能量6 V,梯度高能量20~40 V。碰撞气体:高纯氮气。

2.2.3 供试品溶液的制备

取翠云草粉末(过3号筛)约1 g,精密称定,加90%甲醇水40 mL,称量,加热回流1.5 h,冷却,再称量用90%甲醇水溶液补足减失的量,滤过,摇匀,用0.22 μm微孔滤膜滤过,即得。

2.2.4 对照品溶液的制备

分别精密称取6种对照品,加甲醇溶解配制成含2,3,2″,3″-四氢穗花杉双黄酮47.41 μg·mL-1,2,3,-二氢穗花杉双黄酮49.88 μg·mL-1,穗花杉双黄酮47.45 μg·mL-1,2,3,-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚47.88 μg·mL-1,白果黄素12.82 μg·mL-1和罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚58.11 μg·mL-1的溶液,作为对照品溶液。

2.3 分离化合物鉴定

化合物1  淡黄色结晶性粉末,分子式C31H20O10;UV λmax:280、330 nm;ESI(-):m/z 551([M-H]-)、519([M-H2O]-)。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:13.23(1H,s,5″-OH),12.96(1H,s,5-OH),10.81(1H,s,7-OH),10.80(1H,s,7″-OH),10.36(1H,s,4″′-OH),8.09(1H,brd,J=8.5 Hz,H-6′),7.97(2H,d,J=8.5 Hz,H-2″′,6″′),7.84(1H,brs,H-2′),7.25(1H,d,J = 9.0 Hz,H-5′),6.95(2H,d,J=8.5 Hz,H-3″′,5-″′),6.89(1H,s,H-3),6.83(1H,s,H-3″),6.65(1H,s,H-8″),6.51(1H,brs,H-8),6.20(1H,brs,H-6),3.81(3H,s,4′-OCH3)。以上数据与文献报道的罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚数据[13]基本一致,故鉴定化合物1为罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚,结构式见图 1

图 1 分离鉴定的4个化合物的结构式 Figure 1 Structural formula of four compounds isolated and identified

化合物2  淡黄色结晶性粉末,分子式C30H22O10;UV λmax:290 nm;ESI(-):m/z 541([M-H]-)、389(Ⅰ环RDA裂解4位羰基开环)。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:2.60~2.80和3.10~3.30(4H,m,H-3,3″),5.40(2H,m,H-2,2″),5.88(2H,s,H-6,8),6.02(1H,s,H-6″),6.68(2H,d,J=10.5 Hz,H-3″′,5″′),6.82(1H,d,J = 11.0 Hz,H-5′),7.20(2H,overlap,H-2′,6′),7.19(2H,d,J = 10.5 Hz,H-2″′,6″′),9.48~10.77(7,7″,4′,4″′-OH),12.16(s,1H,5-OH),12.27(s,1H,5″-OH)。以上数据与文献报道的2,3,2″,3″-四氢穗花杉双黄酮数据[14]基本一致,因此鉴定化合物2为2,3,2″,3″-四氢穗花杉双黄酮,结构式见图 1

化合物3  淡黄色结晶性粉末,分子式C30H20O10;UVmax λ:280、330 nm。ESI(-):m/z539([M-H]-)、387(Ⅰ环RDA裂解4位羰基开环)。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:2.66和3.32(2H,m,H-3),5.51(1H,dd,J=14.5,2.5 Hz,H-2),5.88(2H,s,H-6,8),6.30(1H,s,H-6″),6.76(1H,s,H-3″),6.77(2H,d,J=8.5 Hz,H-3″′,5″′),6.99(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),7.40(1H,d,J=8.5 Hz,H-6′),7.41(1H,s,H-2′),7.59(2H,d,J=8.5 Hz,H-2″′,6″′),10.31(4H,7,4′,7″,4″′-OH),12.15(s,1H,5-OH),13.08(s,1H,5″-OH).以上数据与文献[9]报道的基本一致,因此鉴定化合物3为2,3-二氢穗花杉双黄酮,结构式见图 1

化合物4  淡黄色结晶性粉末,分子式C31H22O10;UVmax λ:270、340 nm。ESI(-):m/z553([M-H]-)、509([M-COO]-)。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:2.65和3.30(2H,m,H-3),3.60(3H,s,4′-OMe),5.51(1H,brd,J=13.0 Hz,H-2),5.77(1H,s,H-6),5.81(1H,s,H-8),6.30(1H,s,H-6″),6.73(1H,s,H-3″),6.77(2H,dd,J=9.0,5.0 Hz,H-3″′,5″′),7.17(1H,dd,J=8.5 Hz,H-5′),7.45(1H,overlap,H-2′),7.49(2H,dd,J=9.0,5.0 Hz,H-2″′,6″′),7.55(1H,m,H-6′),12.19(s,1H,5-OH),13.05(s,1H,5″-OH)。以上数据与文献报道的2,3-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚数据[15]基本一致,因此鉴定化合物4为2,3-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚,结构式见图 1

2.4 LC-MS特征峰的归属

取“2.2”项下制备的对照品及供试品溶液,采用超高效液相色谱-二极管阵列-四极杆-飞行时间色谱仪(UPLC-DAD-Q-TOF),按“2.2”项下所述液相色谱及质谱条件进样分析得供试品溶液紫外图(图 2-A)及总离子流图(图 2-B),其中峰1、4、6、11、12、13分别与对照品进行对照确定。对未知化合物进行定性,利用MSE和MSn采集方式,在一级质谱信息中获得高精准的母离子,二级质谱信息中获得碎片信息,根据MS/MS裂解途径,分析已知双黄酮化合物裂解规律,参考裂解规律及文献报道[16],推断目标未知化合物的结构。

1. 2,3,2″,3″-四氢穗花杉双黄酮(2,3,2″,3″-tetrahydroamentoflavone)4. 2,3,-二氢穗花杉双黄酮(2,3-dihydroamentoflavone)6.穗花杉双黄酮(amentoflavone)11. 2,3-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚(2,3-dihydroamentoflavone-4′-methyl ether)12.白果黄素(bilotein)13.罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚(robustaflavone-4′-methyl ether) 图 2 翠云草供试品溶液色谱图(A)及总离子流图(ESI-)(B) Figure 2 Chromatograms (A) and TIC chromatogram (B) of sample S.uncinata
2.4.1 双黄酮质谱裂解规律的研究

双黄酮化合物的裂解途径和黄酮的裂解有共通之处[17],母核C环会发生开裂,产生RDA裂解;其次会发生各种中性丢失,如失去CO2、H2O、CO等分子;另外还会发生C环断裂后重排失去中性分子C2H2O等。饱和双黄酮(穗花杉双黄酮)易发生Ⅱ-C环0,2位和0,4位的断裂,四氢化(2,3,2″′,3″′-四氢穗花杉双黄酮)后的双黄酮易发生Ⅰ-C环1,3位和0,4位的断裂。二氢双黄酮(2,3,-二氢穗花杉双黄酮)优先发生氢化的C环开裂,因为当环的C2和C3间为单键连接时,3个六元环不能形成大共扼体系,环的稳定性相对较差,很容易发生开环反应。罗波斯塔类双黄酮为3′,6″双芹菜素型双黄酮,Ⅱ环5′,7′位羟基易于Ⅰ环4′的羟基(或甲氧基)发生脱水(或CH3OH)。而穗花杉类为3′,8′双芹菜素型双黄酮,只能发生Ⅰ环4′与Ⅱ环7′位的脱水(或CH3OH),故罗波斯塔双黄酮比穗花杉双黄酮更易脱水(或CH3OH)。对照品及分离鉴定化合物质谱图(图 3)。

图 3 对照品及分离鉴定化合物MS图(A)MS2图(B) Figure 3 MS spectra (A) and MS2spectra (B) of two standards and four compounds isolated and identified

罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚,其为C′3-C″6连接的双黄酮类化合物,其负离子模式下的电喷雾质谱碎片见图 4。推断罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚可能的裂解途径:Ⅱ-C环发生0,4键断裂,得到m/z 389的碎片离子峰;第2种裂解途径Ⅰ-B环C-4′位的甲氧基与Ⅱ-A环C7″上的羟基出现分子内脱CH3OH,产生m/z 519的碎片,紧接着m/z 519的碎片连续发生Ⅱ-C环1,3键和Ⅰ-C环0,4键的断裂,生成m/z 293的碎片离子;第3种的裂解途径为:Ⅰ-C环脱去-CH3和CO2得到m/z 493的碎片离子峰;第4种的裂解途径为Ⅱ-C环出现0,2键断裂,得到m/z 431的碎片离子峰,其中m/z 431、389丰度很小。

图 4 罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚可能的裂解途径 Figure 4 Supposed fragmentation pathway of robustaflavone-4′-methyl ether
2.4.2 供试品中未知化合物的推断

根据已知对照品裂解规律及DAD图紫外吸收特征,对翠云草的其他峰进行定性分析。黄酮结构中的桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共扼体系,双黄酮的吸收具有强度很高的2个紫外吸收带,峰带Ⅱ最大吸收位于280 nm左右,峰带Ⅰ最大吸收位于330 nm左右。饱和双黄酮在280 nm、330 nm处有强吸收,饱和穗花杉双黄酮类在280 nm和330 nm的紫外吸收强度相差不大,表现为280 nm略强于330 nm,而饱和罗波斯塔双黄酮类则相反,表现为330 nm略强于280 nm处紫外吸收。二氢双黄酮的1个C环被氢化,失去1个桂皮酰基系统,表现为在330 nm左右处有弱吸收。四氢双黄酮的2个C环都被氢化,不具有桂皮酰基系统,在330 nm处无吸收,由此可以判断双黄酮化合物的母核。以峰3(四氢双黄酮类)及峰10(二氢双黄酮-4′-甲醚)为例说明推断过程。

峰3:通过紫外吸收及[M-H]-分子离子峰判断其为四氢双黄酮类化合物,一级质谱图见图 5-A1、二级质谱图见图 5-B1,紫外吸收图见图 6-A1。对比质谱图发现,此化合物的质谱图与峰1的质谱图基本一致,通过对照品对比可知峰1为四氢穗花杉双黄酮,故此化合物结构与四氢穗花杉双黄酮相似,而卷柏中双黄酮类母核一般为穗花杉双黄酮型、罗波斯塔双黄酮型和扁柏双黄酮型,扁柏双黄酮与穗花杉双黄酮和罗波斯塔双黄酮结构差异大,为醚型,故推测此化合物为2,3,2″,3″-四氢罗波斯塔双黄酮。推测此化合物的裂解途径可能如图 7

图 5 峰3MS(A1)、峰3MS2(B1)、峰10MS(A2)和峰10MS2(B2)图 Figure 5 MS spectra of peak 3(A1), peak 10(B1) and MS2 spectra of peak 3(A2), peak 10(B2)

图 6 峰3(A1)、峰10(A2)紫外吸收图 Figure 6 UV spectra of of peak 3(A1) and peak 10(A2)

图 7 供试品峰3可能的裂解途径 Figure 7 Supposed fragmentation pathway of peak 3

峰10:通过紫外判断其为二氢双黄酮,[M-H]-分子离子峰判断为二氢双黄酮-甲醚类化合物,一级质谱图见图 5-A2、二级质谱图见图 5-B2,紫外吸收图见图 6-A2。该化合物存在m/z 521碎片离子,为Ⅰ-B环C4′位上的羟基或甲氧基与Ⅱ-B环7″位上的羟基或甲氧基脱CH3OH形成,故甲氧基可能位置为4′或7″,根据m/z 375可推断此化合物为2″,3″-二氢双黄酮,故可推断此化合物为二氢穗花杉双黄酮-7″-甲醚或2″,3″-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚。通过文献报道[10],翠云草中含有2″,3″-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚,故推测此化合物为2″,3″-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚。可能的裂解途径如图 8

图 8 供试品峰10可能的裂解途径 Figure 8 Supposed fragmentation pathway of peak 10

经MS及DAD定性研究,共鉴定14个成分,其中6个由对照品比对,8个根据已知对照品的裂解规律并结合文献推导而得。具体结论见表 1

表 1 翠云草中黄酮类化合物结构推断 Table 1 Supposed flavnoid compounds of S. uncinata
3 结论

本研究通过柱色谱分离、波谱解析得到4个单体成分,为制订翠云草质量标准提供了对照品物质基础;通过LC-MS方法结合对照品质谱裂解规律,归属了另外10个双黄酮类成分,为其指纹图谱分析提供了依据。初步分析,翠云草中双黄酮母核以穗花杉双黄桐及罗波斯塔双黄酮为主,结构中有氢化或甲氧取代,所鉴定的14个成分均在260~280 nm有最大吸收,可选择在该波长范围内,制订双黄酮类成分总量的紫外测定方法。

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