2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
2. 武汉理工大学, 武汉 430070
2. Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China
翠云草Selaginella uncinata（Desv.）Spring为卷柏科卷柏属多年生草本植物，具有清热解毒、凉血止血等功效，用于治疗肺热咳嗽、黄疸、痢疾、咽喉肿痛、跌打损伤、多种出血等病症[1-3]。主要分布于广西、贵州、四川、湖北、湖南等地，目前收载于湖北、广东、广西等地方中药材质量标准。
据文献报道，卷柏属植物中主要化学成分为黄酮类化合物，以芹菜素及其衍生物为基本母核，如穗花衫双黄酮、异柳杉双黄酮、扁柏双黄酮、苏铁双黄酮及芹菜素等。通过C-C或者C-O-C连接而成，按照母核连接方式可分为3种类型[4]：3′，8″-双芹菜素型（即amentoflavone型）（A型）、3′，6″-双芹菜素型（即robustaflavone型）（B型）及4′-O-6″双苯醚型（即hinokiflavone型）（C型）。翠云草据报道含有多种双黄酮类成分[5-12]，结构以穗花杉双黄酮与罗波斯塔双黄酮母核为主，包括氢化母核、甲氧基取代等多种类型。
本文首先采用提取分离结合谱学分析技术，从翠云草中分离得到4个单体双黄酮类化合物；再采用LC-UV-MS技术，研究翠云草中已知化合物的质谱裂解规律，推测出其他成分，共归属14个成分峰；分析翠云草中双黄酮化合物的结构特点，为整体评价翠云草质量提供依据。
1 仪器与材料BUCHI公司B-540型BUCHI熔点测定仪；Bruker公司AV-500核磁共振仪；Waters ACQUITY UPLCXevo G2-Q-TOF液质联用色谱仪；安捷伦公司1200高效液相色谱仪DAD检测器；薄层色谱硅胶及柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）。ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；Mettler XP-204电子天平。纯净水为Milli-Q超纯水，其余试剂均为分析纯。
穗花杉双黄酮对照品含量90.2%，（批号111902-201102）购于中国食品药品检定研究院；白果黄素（含量 > 98%）购于天津一方科技有限公司。
样品于2016年9月采自湖北宜昌车溪，由中南民族大学万定荣教授鉴定为卷柏科植物翠云草Selaginella uncinata（Desv.）Spring的干燥全草。
2 方法与结果 2.1 提取与分离取翠云草5 kg，加10倍量的95%乙醇水加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，干燥，得乙酸乙酯部位60 g。取乙酸乙酯部位60 g，以三氯甲烷-甲醇（1:1）超声（功率160 W，频率30 kHz）处理30 min使溶解，上硅胶柱（200~300目），用三氯甲烷-甲醇（80:1→5:1）梯度洗脱，经色谱分析得到目标成分的组分，经半制备HPLC（250 mm×20 mm，5 μm）精制，乙腈-水（40:60）为流动相洗脱，继而重结晶精制，分别得到化合物1（65 mg）、2（10 mg）、3（10 mg）、4（10 mg）。
2.2 LC-MS方法 2.2.1 液相色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：以乙腈为流动相A、以水（含0.1%甲酸）为流动相B，流速0.2 ml·min-1，进行梯度洗脱（0~40 min，35%B→60%B，40~42 min，60%B→90%B，42~45 min，90%B→35%B，45~52 min，35%B）；DAD检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量：1 μL。
2.2.2 质谱条件电喷雾负离子模式（ESI-）检测；毛细管电压2. 8 kV；锥孔电压20 V；离子源温度100 ℃；洗脱溶剂温度300 ℃；脱溶剂气流量350 L·h-1，锥孔反吹气50 L·h-1。采集：采集方法是MSE，采集时间52 min。扫描范围m/z 100~1 500。碰撞能量：低能量6 V，梯度高能量20~40 V。碰撞气体：高纯氮气。
2.2.3 供试品溶液的制备取翠云草粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，加90%甲醇水40 mL，称量，加热回流1.5 h，冷却，再称量用90%甲醇水溶液补足减失的量，滤过，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2.4 对照品溶液的制备分别精密称取6种对照品，加甲醇溶解配制成含2，3，2″，3″-四氢穗花杉双黄酮47.41 μg·mL-1，2，3，-二氢穗花杉双黄酮49.88 μg·mL-1，穗花杉双黄酮47.45 μg·mL-1，2，3，-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚47.88 μg·mL-1，白果黄素12.82 μg·mL-1和罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚58.11 μg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。
2.3 分离化合物鉴定化合物1 淡黄色结晶性粉末，分子式C31H20O10；UV λmax：280、330 nm；ESI（-）：m/z 551（[M-H]-）、519（[M-H2O]-）。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：13.23（1H，s，5″-OH），12.96（1H，s，5-OH），10.81（1H，s，7-OH），10.80（1H，s，7″-OH），10.36（1H，s，4″′-OH），8.09（1H，brd，J=8.5 Hz，H-6′），7.97（2H，d，J=8.5 Hz，H-2″′，6″′），7.84（1H，brs，H-2′），7.25（1H，d，J = 9.0 Hz，H-5′），6.95（2H，d，J=8.5 Hz，H-3″′，5-″′），6.89（1H，s，H-3），6.83（1H，s，H-3″），6.65（1H，s，H-8″），6.51（1H，brs，H-8），6.20（1H，brs，H-6），3.81（3H，s，4′-OCH3）。以上数据与文献报道的罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚数据[13]基本一致，故鉴定化合物1为罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚，结构式见图 1。
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图 1 分离鉴定的4个化合物的结构式 Figure 1 Structural formula of four compounds isolated and identified |
化合物2 淡黄色结晶性粉末，分子式C30H22O10；UV λmax：290 nm；ESI（-）：m/z 541（[M-H]-）、389（Ⅰ环RDA裂解4位羰基开环）。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：2.60~2.80和3.10~3.30（4H，m，H-3，3″），5.40（2H，m，H-2，2″），5.88（2H，s，H-6，8），6.02（1H，s，H-6″），6.68（2H，d，J=10.5 Hz，H-3″′，5″′），6.82（1H，d，J = 11.0 Hz，H-5′），7.20（2H，overlap，H-2′，6′），7.19（2H，d，J = 10.5 Hz，H-2″′，6″′），9.48~10.77（7，7″，4′，4″′-OH），12.16（s，1H，5-OH），12.27（s，1H，5″-OH）。以上数据与文献报道的2，3，2″，3″-四氢穗花杉双黄酮数据[14]基本一致，因此鉴定化合物2为2，3，2″，3″-四氢穗花杉双黄酮，结构式见图 1。
化合物3 淡黄色结晶性粉末，分子式C30H20O10；UVmax λ：280、330 nm。ESI（-）：m/z539（[M-H]-）、387（Ⅰ环RDA裂解4位羰基开环）。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：2.66和3.32（2H，m，H-3），5.51（1H，dd，J=14.5，2.5 Hz，H-2），5.88（2H，s，H-6，8），6.30（1H，s，H-6″），6.76（1H，s，H-3″），6.77（2H，d，J=8.5 Hz，H-3″′，5″′），6.99（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），7.40（1H，d，J=8.5 Hz，H-6′），7.41（1H，s，H-2′），7.59（2H，d，J=8.5 Hz，H-2″′，6″′），10.31（4H，7，4′，7″，4″′-OH），12.15（s，1H，5-OH），13.08（s，1H，5″-OH）.以上数据与文献[9]报道的基本一致，因此鉴定化合物3为2，3-二氢穗花杉双黄酮，结构式见图 1。
化合物4 淡黄色结晶性粉末，分子式C31H22O10；UVmax λ：270、340 nm。ESI（-）：m/z553（[M-H]-）、509（[M-COO]-）。1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ：2.65和3.30（2H，m，H-3），3.60（3H，s，4′-OMe），5.51（1H，brd，J=13.0 Hz，H-2），5.77（1H，s，H-6），5.81（1H，s，H-8），6.30（1H，s，H-6″），6.73（1H，s，H-3″），6.77（2H，dd，J=9.0，5.0 Hz，H-3″′，5″′），7.17（1H，dd，J=8.5 Hz，H-5′），7.45（1H，overlap，H-2′），7.49（2H，dd，J=9.0，5.0 Hz，H-2″′，6″′），7.55（1H，m，H-6′），12.19（s，1H，5-OH），13.05（s，1H，5″-OH）。以上数据与文献报道的2，3-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚数据[15]基本一致，因此鉴定化合物4为2，3-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚，结构式见图 1。
2.4 LC-MS特征峰的归属取“2.2”项下制备的对照品及供试品溶液，采用超高效液相色谱-二极管阵列-四极杆-飞行时间色谱仪（UPLC-DAD-Q-TOF），按“2.2”项下所述液相色谱及质谱条件进样分析得供试品溶液紫外图（图 2-A）及总离子流图（图 2-B），其中峰1、4、6、11、12、13分别与对照品进行对照确定。对未知化合物进行定性，利用MSE和MSn采集方式，在一级质谱信息中获得高精准的母离子，二级质谱信息中获得碎片信息，根据MS/MS裂解途径，分析已知双黄酮化合物裂解规律，参考裂解规律及文献报道[16]，推断目标未知化合物的结构。
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1. 2，3，2″，3″-四氢穗花杉双黄酮（2，3，2″，3″-tetrahydroamentoflavone）4. 2，3，-二氢穗花杉双黄酮（2，3-dihydroamentoflavone）6.穗花杉双黄酮（amentoflavone）11. 2，3-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚（2，3-dihydroamentoflavone-4′-methyl ether）12.白果黄素（bilotein）13.罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚（robustaflavone-4′-methyl ether） 图 2 翠云草供试品溶液色谱图（A）及总离子流图（ESI-）（B） Figure 2 Chromatograms (A) and TIC chromatogram (B) of sample S.uncinata |
双黄酮化合物的裂解途径和黄酮的裂解有共通之处[17]，母核C环会发生开裂，产生RDA裂解；其次会发生各种中性丢失，如失去CO2、H2O、CO等分子；另外还会发生C环断裂后重排失去中性分子C2H2O等。饱和双黄酮（穗花杉双黄酮）易发生Ⅱ-C环0，2位和0，4位的断裂，四氢化（2，3，2″′，3″′-四氢穗花杉双黄酮）后的双黄酮易发生Ⅰ-C环1，3位和0，4位的断裂。二氢双黄酮（2，3，-二氢穗花杉双黄酮）优先发生氢化的C环开裂，因为当环的C2和C3间为单键连接时，3个六元环不能形成大共扼体系，环的稳定性相对较差，很容易发生开环反应。罗波斯塔类双黄酮为3′，6″双芹菜素型双黄酮，Ⅱ环5′，7′位羟基易于Ⅰ环4′的羟基（或甲氧基）发生脱水（或CH3OH）。而穗花杉类为3′，8′双芹菜素型双黄酮，只能发生Ⅰ环4′与Ⅱ环7′位的脱水（或CH3OH），故罗波斯塔双黄酮比穗花杉双黄酮更易脱水（或CH3OH）。对照品及分离鉴定化合物质谱图（图 3）。
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图 3 对照品及分离鉴定化合物MS图（A）MS2图（B） Figure 3 MS spectra (A) and MS2spectra (B) of two standards and four compounds isolated and identified |
罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚，其为C′3-C″6连接的双黄酮类化合物，其负离子模式下的电喷雾质谱碎片见图 4。推断罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚可能的裂解途径：Ⅱ-C环发生0，4键断裂，得到m/z 389的碎片离子峰；第2种裂解途径Ⅰ-B环C-4′位的甲氧基与Ⅱ-A环C7″上的羟基出现分子内脱CH3OH，产生m/z 519的碎片，紧接着m/z 519的碎片连续发生Ⅱ-C环1，3键和Ⅰ-C环0，4键的断裂，生成m/z 293的碎片离子；第3种的裂解途径为：Ⅰ-C环脱去-CH3和CO2得到m/z 493的碎片离子峰；第4种的裂解途径为Ⅱ-C环出现0，2键断裂，得到m/z 431的碎片离子峰，其中m/z 431、389丰度很小。
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图 4 罗波斯塔双黄酮-4′-甲醚可能的裂解途径 Figure 4 Supposed fragmentation pathway of robustaflavone-4′-methyl ether |
根据已知对照品裂解规律及DAD图紫外吸收特征，对翠云草的其他峰进行定性分析。黄酮结构中的桂皮酰基及苯甲酰基组成的交叉共扼体系，双黄酮的吸收具有强度很高的2个紫外吸收带，峰带Ⅱ最大吸收位于280 nm左右，峰带Ⅰ最大吸收位于330 nm左右。饱和双黄酮在280 nm、330 nm处有强吸收，饱和穗花杉双黄酮类在280 nm和330 nm的紫外吸收强度相差不大，表现为280 nm略强于330 nm，而饱和罗波斯塔双黄酮类则相反，表现为330 nm略强于280 nm处紫外吸收。二氢双黄酮的1个C环被氢化，失去1个桂皮酰基系统，表现为在330 nm左右处有弱吸收。四氢双黄酮的2个C环都被氢化，不具有桂皮酰基系统，在330 nm处无吸收，由此可以判断双黄酮化合物的母核。以峰3（四氢双黄酮类）及峰10（二氢双黄酮-4′-甲醚）为例说明推断过程。
峰3：通过紫外吸收及[M-H]-分子离子峰判断其为四氢双黄酮类化合物，一级质谱图见图 5-A1、二级质谱图见图 5-B1，紫外吸收图见图 6-A1。对比质谱图发现，此化合物的质谱图与峰1的质谱图基本一致，通过对照品对比可知峰1为四氢穗花杉双黄酮，故此化合物结构与四氢穗花杉双黄酮相似，而卷柏中双黄酮类母核一般为穗花杉双黄酮型、罗波斯塔双黄酮型和扁柏双黄酮型，扁柏双黄酮与穗花杉双黄酮和罗波斯塔双黄酮结构差异大，为醚型，故推测此化合物为2，3，2″，3″-四氢罗波斯塔双黄酮。推测此化合物的裂解途径可能如图 7。
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图 5 峰3MS（A1）、峰3MS2（B1）、峰10MS（A2）和峰10MS2（B2）图 Figure 5 MS spectra of peak 3(A1), peak 10(B1) and MS2 spectra of peak 3(A2), peak 10(B2) |
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图 6 峰3（A1）、峰10（A2）紫外吸收图 Figure 6 UV spectra of of peak 3(A1) and peak 10(A2) |
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图 7 供试品峰3可能的裂解途径 Figure 7 Supposed fragmentation pathway of peak 3 |
峰10：通过紫外判断其为二氢双黄酮，[M-H]-分子离子峰判断为二氢双黄酮-甲醚类化合物，一级质谱图见图 5-A2、二级质谱图见图 5-B2，紫外吸收图见图 6-A2。该化合物存在m/z 521碎片离子，为Ⅰ-B环C4′位上的羟基或甲氧基与Ⅱ-B环7″位上的羟基或甲氧基脱CH3OH形成，故甲氧基可能位置为4′或7″，根据m/z 375可推断此化合物为2″，3″-二氢双黄酮，故可推断此化合物为二氢穗花杉双黄酮-7″-甲醚或2″，3″-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚。通过文献报道[10]，翠云草中含有2″，3″-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚，故推测此化合物为2″，3″-二氢穗花杉双黄酮-4′-甲醚。可能的裂解途径如图 8。
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图 8 供试品峰10可能的裂解途径 Figure 8 Supposed fragmentation pathway of peak 10 |
经MS及DAD定性研究，共鉴定14个成分，其中6个由对照品比对，8个根据已知对照品的裂解规律并结合文献推导而得。具体结论见表 1。
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表 1 翠云草中黄酮类化合物结构推断 Table 1 Supposed flavnoid compounds of S. uncinata |
本研究通过柱色谱分离、波谱解析得到4个单体成分，为制订翠云草质量标准提供了对照品物质基础；通过LC-MS方法结合对照品质谱裂解规律，归属了另外10个双黄酮类成分，为其指纹图谱分析提供了依据。初步分析，翠云草中双黄酮母核以穗花杉双黄桐及罗波斯塔双黄酮为主，结构中有氢化或甲氧取代，所鉴定的14个成分均在260~280 nm有最大吸收，可选择在该波长范围内，制订双黄酮类成分总量的紫外测定方法。
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