2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
2. 成都大学医学院代谢组学协同创新实验室, 羌医药标准研究推广基地暨协同创新中心, 成都 610106
2. College of Medicine, Chengdu University, Collaborative Innovation Laboratory of Metabonomics, Standard Research and Extension base, Collaborative Innovation Center of Qiang Medicine, Chengdu 610106, China
美洲大蠊（Peripaneta americana Linnaeus），为节肢动物门蜚蠊目蜚蠊科昆虫，是传统动物药蜚蠊中的一种，常用于胁痛、癥瘕、疳疾、心悸、气喘、水肿、水火烫伤以及各种创伤溃疡等[1]。其现代中药制剂——康复新液是由美洲大蠊干燥虫体提取物精制而成，具有通利血脉、养阴生肌之效，其临床应用广泛，尤其在消化系统疾病、创面修复治疗方面疗效显著[2-4]。在康复新液及其原生药材美洲大蠊中，氨基酸是其主要且含量较为丰富的成分，亦是药物发挥临床疗效的重要物质基础成分之一[5]。全面了解康复新液不同生产制备环节中氨基酸成分变化情况，掌握生产制备工艺对氨基酸成分变化的影响程度，分析对其变化影响显著的组分，对于进一步控制药品质量，深入研究探讨康复新液中氨基酸成分含量与相对比例的变化对临床治疗效果具有重要意义。
因此，本试验利用HPLC定量分析方法结合偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）多变量分析模型，采用柱前衍生化法对康复新液制备过程中12种游离氨基酸成分变化进行测定，分析比较美洲大蠊药材以及由其所制备的提取物和制剂康复新液三者中氨基酸成分轮廓差异，期望从化学轮廓差异角度，更为全面控制康复新液在生产制备中间环节的药品质量，保障药物临床疗效；所建立的美洲大蠊药材、中间提取物、制剂三者中游离氨基酸成分的含量测定方法，亦可为康复新液质量评价体系提供一种新的质量控制方法。
1 仪器与材料 1.1 仪器Waters 2695高效液相色谱仪，包括四元泵系统、全自动脱气单元、VWD检测器单元和Waters 2695色谱工作站等（Waters Techology）；SB-100 DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；UPT-Ⅱ-10T型超纯水器（成都超纯科技有限公司）；HH-4数控恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；Vortex Genius 3型涡旋振荡仪（IKA，German）；空冷型离心机（Select BioProducts，USA）；FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2 药物美洲大蠊药材、美洲大蠊提取物、康复新液均由四川好医生药业集团有限公司提供，各批次样品批号及对应信息见表 1，每一批次美洲大蠊提取物、制剂成品均由相应批次药材提取制得。
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表 1 各批次美洲大蠊药材、提取物、制剂间对应信息表 Table 1 Sample information of different crude drugs, extracts, and preparations |
对照品谷氨酰胺（glutamine，Gln）、丝氨酸（serine，Ser）、天冬氨酸（aspartic acid，Asp）、精氨酸（arginine，Arg）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、牛磺酸（taurine，Tau）、苏氨酸（threonine，Thr）、赖氨酸（lysine，Lys）、甲硫氨酸（methionine，Met）、缬氨酸（valine，Val）、亮氨酸（leucine，Leu）、异亮氨酸（isoleucine，Ile）为生化试剂，纯度均大于98%，均购于Sigma公司。2，4-二硝基氟苯（fluorodinitrobenzene，FDNB）为衍生试剂，批号20145090801）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 实验方法 2.1 色谱条件采额头Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相A为乙酸铵-乙酸水溶液（每1 000 mL含4 mL乙酸和1.54 g乙酸铵），流动相B为70%乙腈，梯度洗脱（0~5 min，70%A；5~8 min，70%A→68.5%A；8~12 min，68.5%A→67%A；12~16 min，67%A→65%A；16~17 min，65%A→62%A；17~18 min，62%A→61%A；18~23 min，61%A→59%A；23~24 min，59%A→49%A；24~31 min，49%A→40%A；31~33 min，40%A→35%A；33~35 min，35%A→30%A；35~37 min，30%A；37~38 min，30%A→70%A；38~40 min，70%A；流速1.0 mL·min-1，检测波长360 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。
2.2 混合对照品溶液的配制精密称取12种氨基酸对照品适量，置于25 mL棕色量瓶中，加纯化水溶解并定容至刻度，摇匀，制成含Lys 976 μg·mL-1、Asp 676 μg·mL-1、Arg 660 μg·mL-1、Leu 872 μg·mL-1、Tau 912 μg·mL-1、Val 992 μg·mL-1、Gln 608 μg·mL-1、Glu 1 292 μg·mL-1、Ile 628 μg·mL-1、Thr 680 μg·mL-1、Met 572 μg·mL-1、Ser 608 μg·mL-1的混合对照品溶液（S1）。
2.3 供试品溶液的配制精密称取不同批次的美洲大蠊药材0.5 g，置25 mL量瓶中，精密加入水至刻度，称量，室温超声处理30 min（功率100 W，频率40 kHz），称量，加水补足减失的量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过后，取续滤液，即得药材供试品溶液；精密量取不同批次的美洲大蠊提取物5 mL、制剂2.5 mL，分别置25 mL量瓶中，精密加入水至刻度，涡旋处理2 min，经0.45 μm微孔滤膜滤过后，取续滤液，即得提取物供试品溶液与制剂供试品溶液。
2.4 FDNB衍生化精密量取上述混合对照品溶液、供试品溶液各100 μL，分别置于1.5 mL离心管内，加入1% FDNB-乙腈溶液和50 mmol·L-1 NaHCO3缓冲液各100 μL，振荡混匀，于60 ℃恒温避光水浴30 min，取出，冷至室温，加入0.2%甲酸水溶液700 μL，涡旋2 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，备用。
2.5 系统适用性考察取混合对照品溶液S1、供试品溶液，按“2.4”项下方法进行衍生化，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，结果见图 1。12种氨基酸在选定的色谱条件下可被有效分离，理论塔板数均大于5 000，拖尾因子符合分析要求，供试品溶液中其他物质不干扰12种氨基酸的测定。
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1. Gln 2. Ser 3. Asp 4. Arg 5. Glu 6. Tau 7. Thr 8. Met 9. Val 10. Leu 11. Ile 12. Lys a.混合对照品（mixed reference substances）b.美洲大蠊药材（crude drugs）c.美洲大蠊提取物（extracts）d.制剂（preparations） 图 1 混合对照品溶液与美洲大蠊药材、提取物和制剂中12种游离氨基酸HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of 12 amino acids in different crude drugs, extracts, preparations, and mixed reference substances |
采用倍数稀释法，精密吸取“2.2”项下制备的混合对照品溶液（S1）5 mL，置10 mL棕色量瓶中，加水稀释定容至10 mL，得混合对照品溶液S2；按上法依次制得混合对照品溶液S3~S6。按“2.4”项下方法进行衍生化，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰。以色谱峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程、相关系数、线性范围，结果见表 2。结果表明，12种氨基酸在各自的质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。
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表 2 氨基酸标准曲线方程及线性关系 Table 2 Standard curve equations and linear relations of 12 amino acids |
选择3号对照品溶液（S3），按“2.4”项下方法衍生化，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，记录各氨基酸峰面积数据，其峰面积的RSD分别为Lys 1.2%、Asp 1.5%、Arg 0.24%、Leu 0.47%、Tau 0.34%、Val 0.89%、Gln 0.301%、Glu 0.32%、Ile 0.61%、Thr 0.39%、Met 0.47%、Ser 0.34%，其RSD均小于1.5%，表明试验精密度良好。
2.8 稳定性试验取制剂供试品溶液，按“2.3”、“2.4”项下方法制备供试品溶液并衍生化，在室温（21 ℃）条件下分别于0、4、8、16、24 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录各氨基酸峰面积数据，其峰面积的RSD分别为Lys 1.8%、Asp 2.0%、Arg 0.34%、Leu 0.56%、Tau 1.4%、Val 0.81%、Gln 1.7%、Glu 0.847%、Ile 1.4%、Thr 0.66%、Met 2.8%、Ser 0.68%，其RSD，均小于3%，表明供试品溶液在24 h内的稳定性较好。
2.9 重复性试验取制剂供试品溶液6份，按“2.3”、“2.4”项下方法进行操作，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积，计算得各氨基酸含量的RSD分别为Lys 1.2%、Asp 1.8%、Arg 0.80%、Leu 0.21%、Tau 1.03%、Val 0.730%、Gln 0.83%、Glu 0.37%、Ile 0.72%、Thr 0.34%、Met 2.5%、Ser 0.389%，其RSD均小于3%，表明该方法的重复性良好。
2.10 加样回收率试验取重复性用试验样品共6份，每份精密吸取0.05 mL，分别精密加入4号对照品溶液（S4）0.05 mL（含Lys 0.122 0 mg、Asp 0.084 5 mg、Arg 0.082 5 mg、Leu 0.109 0 mg、Tau 0.114 0 mg、Val 0.124 0 mg、Gln 0.076 0 mg、Glu 0.161 5 mg、Ile 0.078 5 mg、Thr 0.085 0 mg、Met 0.071 5 mg、Ser 0.076 1 mg），按照“2.4”项下方法衍生化，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算各氨基酸含量。加样回收率按（测得含量-已知样品中的含量）/加入对照品量×100%计算，结果见表 4，12种氨基酸的平均加样回收率在90.2%~111.8%，RSD均小于2.6%，表明该方法加样回收率符合要求。
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表 4 加样回收实验结果表 Table 4 Recovery rates of 12 amino acids |
采用所建立的HPLC方法分别测定不同批次美洲大蠊药材、提取物、制剂中12种氨基酸的相对含量。
2.12 统计学分析采用SPSS statistic 18.0对数据进行统计分析。
3 结果与分析 3.1 含量测定结果不同批次美洲大蠊药材-提取物-制剂中12种氨基酸成分含量测定结果见表 5。不同含量变化见图 2。
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图 2 美洲大蠊药材、提取物及制剂中12种氨基酸含量变化 Figure 2 Content changing of 12 amino acids in different crude drugs, extracts and preparations |
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表 5 不同批次美洲大蠊药材-提取物-制剂中12种氨基酸的含量 Table 5 Contents of 12 amino acids in different crude drugs, extracts and preparations |
不同批次美洲大蠊药材、提取物及制剂康复新液中12种游离氨基酸含量见表 5。图 2显示12种氨基酸含量的总体变化趋势是随着工艺的推进而递减，其中，Lys、Asp、Leu、Tau、Val、Gln、Glu、Ile、Thr、Met共10种氨基酸在药材中含量与其在提取物、制剂中含量相比，具有显著统计学差异性（P < 0.01），药材中Ser含量与其在提取物、制剂中含量相比，具有统计学差异性（P < 0.05）；而制剂中Arg含量有增加的情况，其含量在药材、提取物、制剂间均具有统计学差异性（P < 0.05），其在制剂中含量与药材、提取物相较，具有显著统计学差异性（P < 0.01），这可能与美洲大蠊在工艺过程中蛋白质、肽类等成分发生水解转化有关。
3.2 不同批次美洲大蠊药材-提取物-制剂间12种氨基酸成分含量的多变量数据分析利用SIMCA-P 12.0中PCA进行数据分型，并根据分析载荷图得到潜在的差异氨基酸成分。图 3-A为不同批次美洲大蠊药材-提取物-制剂样品分析得分图，不同批次的美洲大蠊药材样品（YC1~YC10）与提取物（JG1~JG4）、制剂样品（ZJ1~ZJ10，除ZJ4外）间的离散度较大，清晰地分为一类，美洲大蠊提取物与制剂样品间离散度较小，两者分为一类，说明能够通过氨基酸含量的测定将药材与提取物、制剂样品区分开，同时可以看到提取物与制剂样品之间含量存在的差异较小，表明康复新液制备工艺较为稳定，可以得到质量较为均一的中间体及成品。在PCA分析基础上，经PLS-DA分析，其分类情况与PCA结果非常吻合。对PLS-DA打分图的载荷图（loading score）进行分析，结果见图 3-B，其中Met、Tau、Lys、Val（蓝色标记部分）4种氨基酸与Ile、Thr、Leu、Gln、Asp、Glu（绿色标记部分）6种氨基酸较为集中，上述两部分氨基酸加上Ser共11种氨基酸是对药材、提取物、制剂三者间分类影响较大的组分，而Arg更接近于坐标轴中心，则是对药材、提取物、制剂间分类影响最小的组分。图 3-C为变量重要性因子分布图（VIP），VIP越大，变量在美洲大蠊药材、提取物、制剂间差异越显著。其中，Tau、Met、Ile、Leu、Gln的VIP > 1，是对分类来说重要的氨基酸组分，其结果与载荷图分析结果基本一致。
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图 3 不同批次美洲大蠊药材、提取物、制剂样品的PCA得分图（A）、PLS-DA二维因子载荷图（B）和各变量重要性因子（VIP）得分图（C） Figure 3 PCA score plot (A), PLS-DA loadings plot (B) of different samples and VIP score plot (C) of variables |
综上所述，研究结果提示游离氨基酸成分的含量变化，特别是牛磺酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺以及精氨酸6种成分为康复新液质量控制标志物，为做更深层次的质量评价提供依据。
4 讨论本试验选取不同批次美洲大蠊药材及其制备的提取物和制剂成品，确保游离氨基酸成分含量动态分析结果的准确性和可靠性。含量测定结果显示，美洲大蠊药材中12种游离氨基酸含量与其在提取物、制剂中含量差异较大，而提取物与制剂之间差异较小，两者游离氨基酸成分含量相近。其中Lys、Asp、Leu、Tau、Val、Gln、Glu、Ile、Thr、Met、Ser共11种氨基酸在提取物、制剂中含量显著下降，而在制剂中Arg含量显著增加，为测定的3类样品中含量差异最大的成分。PCA分析结果亦表明氨基酸含量在提取物-制剂工艺环节中差异较小，说明康复新液的制备工艺稳定，成品质量均一。通过载荷图和变量重要性因子分布图，可知游离氨基酸含量是影响美洲大蠊药材与康复新液两者存在差异的关键因素之一，其中Tau、Met、Ile、Leu、Gln是对药材、提取物、制剂间分类影响最大的重要组分，在一定程度上影响着药材、提取物、制剂间的差异变化。
研究结果也显示，美洲大蠊药材中游离氨基酸成分含量与中间提取物、制剂游离氨基酸成分含量具有明显差异，含量明显降低，而中间提取物与成品制剂间的氨基酸成分含量差异不明显。但是，测定的12种氨基酸中精氨酸变化比较特殊，从药材到中间提取物过程中含量降低、中间提取物到制剂成品过程中含量增加，这可能是制剂成型过程中不同操作环节（浓缩、收膏、脱脂、过滤、配液、灌装等过程）对所含游离氨基酸成分产生的影响。
分析游离氨基酸成分在不同制备环节中的化学轮廓差异，对于深入了解康复新液不同生产制备环节中氨基酸成分变化情况，掌握生产制备工艺对氨基酸成分变化的影响程度，分析对其变化影响显著的组分，更进一步优化提取制备工艺与质量评价指标，更好地控制药品质量，保证临床疗效具有重要意义。在今后的研究中，课题组亦将更为深入地探讨康复新液制备过程中影响药品质量的关键性成分与药效间的相关性，为康复新液的质量控制提供全面科学依据。
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