2018, Vol. 38 
中药指纹图谱是其化学组成整体性的化学表征，能够反映研究对象尽量多的组分，主要用于评价中药质量的真实性、稳定性和优良性，是全面、整体地控制中药质量最有效的方法之一。经过十几年的研究和运用，中药指纹图谱技术日臻成熟，在中药质量标准控制领域得到很好发展，《中华人民共和国药典》2015年版一部已收载三七通舒胶囊、抗宫炎片、血脂康片/胶囊等指纹图谱质控方法[1]。
护肝片是一种用于治疗慢性肝炎及早期肝硬化的常用基本药物，全方由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉、绿豆6味药材制成，具有疏肝理气、健脾消食和降低转氨酶之功效[2]。方中柴胡具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气功效，化学成分主要有皂苷类及黄酮类化合物，其中柴胡皂苷为其主要活性成分之一，该成分具有增强机体特异性免疫反应[3]，能抗菌消炎[4-5]和抗病毒[6]等；茵陈是一种具有保肝功效的特色中药，可以清利湿热、利胆退黄，其主要化学成分包括黄酮、有机酸、香豆素，临床实践中常与其他中药配伍用于甲、乙型和黄疸型肝炎的治疗[7]；板蓝根具有抗病毒，抗菌，抗内毒素，调节免疫等作用，多用于流行性感冒、乙肝等病毒性疾病的防治，目前，化合物（R，S）-告依春被认为是抗病毒的代表性有效成分之一[8-9]；五味子能够增加机体免疫力[10]，抗肿瘤作用[11]，降血脂保肝[12]，主要含有木脂素和挥发性物质2类化学成分，其中木脂素成分研究较多[13-14]。
中药往往是多成分、多靶点协同发挥作用起到疾病防治目的，较单一或几个组分的成分研究，指纹图谱更加全面、系统和科学。本研究建立了4个厂家23批次护肝片HPLC指纹图谱，并建立被指认的7个共有峰定量检测方法，为系统客观评价及控制护肝片质量提供参考依据。
1 仪器和材料2695型高效液相色谱仪（2489紫外可见光检测器，沃特世公司）；BT-125D型电子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-500ES超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司，功率500 W）。
护肝片23批，通化利民药业有限责任公司生产，批号分别为161005（S1）、161006（S2）、161120（S3）、161125（S4）、161201（S5）；黑龙江葵花药业股份有限公司生产，批号分别为201602090（S6）、201608051（S7）、201610095（S8）、201605054（S9）、201610170（S10）、201610124（S11）；通化爱心药业股份有限公司生产，批号分别为160501（S12）、160510（S13）、160804（S14）、171015（S15）、171105（S16）、171106（S17）；安徽九方制药有限公司生产，批号分别为160510（S18）、160804（S19）、171015（S20）、171105（S21）、160501（S22）、171105（S23）。
对照品（R，S）-告依春（批号111753-201706，含量100%）、柴胡皂苷a（批号110777-201711，含量91.1%）、五味子醇甲（批号110857-201714，含量99.9%）、柴胡皂苷d（批号110778-201711，含量95.8%）、五味子酯甲（批号111529-201706，含量95.2%）、五味子甲素（批号110764-201714，含量99.3%）、五味子乙素（批号110765-201512，含量99%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~6 min，6%A；6~9 min，6%A→40%A；9~30 min，40%A→50%A；30~45 min，50%A；45~65 min，50%A→75%A）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：250 min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液取对照品（R，S）-告依春、柴胡皂苷a、五味子醇甲、柴胡皂苷d、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素各适量，精密称定，加甲醇制成含（R，S）-告依春4.81 μg·mL-1、柴胡皂苷a 7.25 μg·mL-1、五味子醇甲22.43 μg·mL-1、柴胡皂苷d 4.42 μg·mL-1、五味子酯甲4.81 μg·mL-1、五味子甲素5.98 μg·mL-1和五味子乙素9.17 μg·mL-1的混合溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.2 供试品溶液取护肝片10片，去包衣，研细，取粉末1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，称量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理1 h，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3 HPLC指纹图谱的建立 2.3.1 精密度试验取同一批护肝片供试品溶液（批号201602090），在“2.1”项色谱条件下，连续进样6针，记录色谱图，以五味子醇甲为参比峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.4%，相对峰面积的RSD均小于0.8%，表明仪器精密度良好。
2.3.2 稳定性试验取同一批护肝片（批号201602090）供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别在0、3、6、12、15、24 h进样，记录色谱图，以五味子醇甲为参比峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.2%，相对峰面积的RSD均小于2.8%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.3 重复性试验取同一批护肝片样品（批号201602090），按“2.2.2”项下方法平行制备6份溶液，在“2.1”项色谱条件下分析，记录色谱图，以五味子醇甲为参比峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.5%，相对峰面积的RSD均小于1.3%，结果表明方法重复性良好。
2.3.4 指纹图谱的建立及相似度评价取收集的护肝片样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样测定，记录色谱图。将23份护肝片指纹图谱导入国家药典委员会编写的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版）软件进行分析。因S6号样品图谱各峰信号强度较大，分离完全，且峰形较佳，所以将S6号样品的图谱作为参照图谱，时间窗宽度设定为0.20，采用多点校正全谱匹配指纹图谱，并生成指纹图谱共有模式。结果23批护肝片样品指纹图谱中，共确认20个共有峰，23批指纹图谱的相似度分别为0.984、0.985、0.984、0.984、0.984、0.950、0.951、0.951、0.951、0.951、0.951、0.959、0.960、0.959、0.959、0.960、0.959、0.981、0.984、0.983、0.983、0.983、0.983，均大于0.95。指纹图谱叠加图及其共有模式见图 1。
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1.（R，S）-告依春（（R，S）-epigoitrin） 3.柴胡皂苷a（saikosaponin a） 5.五味子醇甲（schisandrin） 6.柴胡皂苷d（saikosaponin d） 8.五味子酯甲（schisantherin） 17.五味子甲素（deoxyschizandrin） 20.五味子乙素（schisandrin B） 图 1 23批护肝片HPLC指纹图谱（A）、对照指纹图谱（B）和混合对照品色谱图（C） Figure 1 Fingerprints of 23 batches of Hugan tablets(A), reference fingerprint(B)and chromatogram of mixed reference substances(C) |
通过与混合对照品色谱图进行比对，可以对指纹图谱中7个化合物进行指认，结果1号峰为（R，S）-告依春，3号峰为柴胡皂苷a，5号峰为五味子醇甲，6号峰为柴胡皂苷d，8号峰为五味子酯甲，17号峰为五味子甲素，20号峰为五味子乙素；其平均保留时间分别为（4.78±0.01）min、（6.28±0.02）min、（24.99± 0.02）min、（26.77±0.03）min、（28.65±0.02）min、（49.11±0.01）min和（54.07±0.02）min。其中5号峰峰位居中，分离度良好，峰面积较大，因此选作参考峰，计算其他共有峰相对峰面积，结果见表 1。
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表 1 23批样品（S1~S23）共有峰相对峰面积 Table 1 The relative peak areas of 20 common chromatographic peaks of 23 samples(S1-S23) |
精密量取“2.2.1”项下（R，S）-告依春、柴胡皂苷a、五味子醇甲、柴胡皂苷d、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素混合对照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至至刻度，摇匀，制成7份不同质量浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样10 μL进行测定，记录色谱图峰面积。以各组分峰面积Y为纵坐标，对照品质量浓度X（μg·mL-1）为横坐标，进行线性回归，得到各组分线性回归方程及相关系数。取浓度混合对照品溶液，按信噪比（S/N）3:1和10:1分别测定各组分检测下限（LLOD）和定量下限（LLOQ），结果见表 2。
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表 2 7个成分的回归方程、检测下限和定量下限 Table 2 Linear regression equations, LODs and LOQs of seven components |
取批号为201602090（S6号样品）的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6针进行分析，记录峰面积。结果（R，S）-告依春、柴胡皂苷a、五味子醇甲、柴胡皂苷d、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面积的RSD分别为0.7%、0.8%、0.4%、1.0%、0.3%、0.4%和0.6%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 稳定性试验取批号为201602090（S6号样品）的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、18、24 h进样，记录峰面积。结果（R，S）-告依春、柴胡皂苷a、五味子醇甲、柴胡皂苷d、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面积的RSD分别为0.6%、1.2%、0.6%、1.1%、0.8%、0.6%和0.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.4 重复性试验取批号为201602090的S6号样品，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果（R，S）-告依春、柴胡皂苷a、五味子醇甲、柴胡皂苷d、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素平均含量分别为0.11、0.17、0.58、0.12、0.12、0.15、0.22 mg·片-1，RSD分别为0.8%、1.0%、0.7%、0.9%、0.5%、0.5%和0.7%，表明本方法重复性良好。
2.4.5 加样回收率试验取批号为201602090的S6号样品0.5 g，共取6份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，各加入含（R，S）-告依春0.058 mg·mL-1、柴胡皂苷a 0.085 mg·mL-1、五味子醇甲0.252 mg·mL-1、柴胡皂苷d 0.056 mg·mL-1、五味子酯甲0.075 mg·mL-1、五味子甲素0.088 mg·mL-1和五味子乙素0.108 mg·mL-1的混合对照品溶液（按“2.2.1”项下方法制备）1 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，依法测定，记录峰面积，计算各组分加样回收率，结果见表 3。
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表 3 护肝片7个成分的加样回收率结果（n=6） Table 3 Recoveries of six maker components in Hugan tablets |
取护肝片供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，按标准曲线法分别计算样品中（R，S）-告依春、柴胡皂苷a、五味子醇甲、柴胡皂昔d、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的平均含量，结果见表 4。
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表 4 7个成分含量测定结果（mg·片-1，n=3） Table 4 Determination of seven marker components |
近年来，中医药工业总产值持续增长，中药也逐步走出国门为世界认可，中医药已成为中国与世界各国开展人文交流, 促进东西方文明交流互鉴的重要内容，故而中药质量的把控尤为重要。因中药制剂多为数种药材制成，所含成分丰富，治疗疾病具有多靶向性等特征，显然传统药品质量检测方法不能客观真实地评价中药质量。中药指纹图谱具有整体性、特征性及模糊性，是一种综合的、可量化的质量鉴别手段，可以对中药质量进行定性和定量评价分析，是一种中药质量系统、客观的评价方式。护肝片是较常用肝病防治基本药物，全方由柴胡、茵陈、板蓝根、五味子、猪胆粉、绿豆6味药材制成，成分复杂，从指纹图谱峰大小和成分含量值可以看出，（R，S）-告依春及柴胡皂苷类成分含量较低，但因其在方中均具有重要作用，故而在护肝片指标成分研究中不可或缺，应在质量控制研究中重点监测，作为评价护肝片质量重要指标之一。
在200~400 nm下对混合对照品溶液进行扫描，发现最大吸收波长为228 nm，但实验发现，利用该波长得到的色谱图干扰峰信号较强，不利于目标成分分离；参考《中华人民共和国药典》2015年版一部护肝片含量项下[1]检测波长250 nm，干扰峰影响消除，目标化合物也能完全显现。流动相摸索过程中，流动相首选甲醇-水和乙腈-水系统，但发现柴胡指标成分柴胡皂苷未能出峰，当利用乙腈-磷酸盐水溶液系统时，目标化合物能有较高响应，其他化合物也能完全分离，所以选择乙腈-0.05%磷酸水溶液作为流动相。
本研究共收集到4个厂家23批次护肝片，建立护肝片的HPLC指纹图谱，共确认指纹图谱中20个共有峰，并指认了其中7个化合物；同时又建立了这7个成分（（R，S）-告依春、柴胡皂苷a、五味子醇甲、柴胡皂苷d、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素）的定量检测方法，并选取4个厂家生产的6批次样品进行含量考察。本方法客观、简捷，重现性好，精密度高，可以为控制护肝片质量提供参考依据。
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