2018, Vol. 38 
2. 郑州大学第三附属医院检验科, 郑州 450052
2. Department of Clinical Laboratory, The Third Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou, 450052, China
不同手性物质的理化性质、药理作用等存在较大差异，因此，手性物质的拆分对于安全合理用药十分重要。目前色谱拆分法[1]在分离手性物质中的应用较为广泛，然而，单一的分析方法很难有效分离分析生物样品中的手性物质，且检测灵敏度相对较低，需要联用多种方法进行检测。近年来，由于化学发光法（chemiluminescence，CL）具有灵敏度高，选择性好，线性范围宽，相对简单和仪器经济等优点，已经成为用于高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）的新型检测方法[2-3]。高效液相色谱-化学发光检测法已经成功用于一些化合物的测定，包括酚类化合物[4-5]、低分子量氨基硫醇[6]和芳香族化合物[7]，目前尚未发现手性衍生色谱-化学发光联用的方法及其应用于手性物质研究领域的报道。本文拟建立手性衍生色谱-化学发光联用法，并对体内外手性化合物进行有效检测。
酪氨酸（tyrosine，Tyr）在生命系统中起着非常重要的作用，D-和L-酪氨酸在人体中具有不同的药理作用[8]。研究体内酪氨酸对映体的检测方法，对于相关疾病如神经系统损害、肝肾损伤、恶性肿瘤等具有非常重要的临床价值。曾有文献报道利用高效液相色谱[9]、毛细管电泳[10]和电化学方法[11]对酪氨酸对映体进行分离分析。然而，这些方法具有灵敏度低，可重复性差或仪器昂贵等缺点。本文通过手性衍生色谱-化学发光联用法，拟对酪氨酸对映体进行高选择性、高灵敏度的检测，并用于生物样品的分析。这一研究结果对神经性疾病、肿瘤等的辅助检测、诊断具有十分重要的意义。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，MD200-2型氮气吹扫仪（杭州奥盛仪器有限公司），流动注射化学发光检测系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）。
1.2 试药D-/L-酪氨酸（北京鼎国生物有限公司）；邻苯二甲醛和N-乙酰基-L-半胱氨酸（纯度 > 90%）（上海阿拉丁试剂有限公司）；鲁米诺（北京索莱宝生物科技有限公司）；高锰酸钾（天津科密欧化学试剂有限公司）。人血清样品来自河南省红十字会血液中心。
2 方法 2.1 D-/L-酪氨酸的柱前衍生称取酪氨酸20 mg，加入0.02 mol·L-1 氢氧化钠溶液10 mL进行溶解，于4 ℃下黑暗处保存2周，制备酪氨酸的标准溶液。称取邻苯二甲醛10 mg和N-乙酰基-L-半胱氨酸30 mg，加入甲醇1.0 mL溶解，每隔1 d制备衍生化试剂。将水500 μL、衍生化试剂200 μL和0.1 mol·L-1 硼酸盐缓冲液（pH 9.6）[准确称取Na4B2O7·10 H2O（科密欧化学试剂有限公司，天津）3.814 g，溶解于100 mL二次蒸馏水中，用2.0 mol·L-1的氢氧化钠溶液调节其pH至9.6]500 μL逐渐加入到100 μL酪氨酸标准溶液中，室温下振荡4 min进行衍生反应，即可得到酪氨酸对映体的衍生物。
2.2 色谱条件色谱柱：Shim-pack ODS分析柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（pH 6.0）；检测器：荧光检测器及化学发光检测器；检测波长：激发波长340 nm，发射波长450 nm；流速：0.3~1.1 mL· min-1；柱温：15~35 ℃；进样量：20 μL。
2.3 生物样品的预处理取人血浆样品100 μL于1.5 mL离心管中，加入甲醇300 μL，用来沉淀蛋白，充分涡旋3 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min，吸取上清，在25 ℃的氮气流下吹干，用去离子水复溶后稀释到标准曲线范围内进行测定。以不含样品的血浆作空白对照。从河南省实验动物中心购入3只小鼠，体质量20~30 g，每只小鼠尾静脉注射35 mg·kg-1 酪氨酸对映体，小鼠给药10 min后收集小鼠眼眶静脉血样，在4 ℃、4 000 r·min-1离心10 min得血浆样品。精密量取小鼠血浆样品各100 μL，按以上方法进行预处理。
2.4 实验方法酪氨酸对映体首先在25 ℃、0.7 mL·min-1的条件下，采用ODS柱在高效液相色谱仪上进行手性分离，色谱柱流出液（包含样品和流动相混合液）通过PEEK管与鲁米诺溶液、高锰酸钾溶液在混合器里混合，并同时进入流通池检测化学发光信号，该化学发光信号由光电倍增管来检测。本研究采用相对化学发光强度ΔI=Is-I0对样品进行定量分析，其中Is为加入酪氨酸对映体后的化学发光信号，而I0是空白溶液的化学发光信号。
3 实验结果手性衍生化试剂法（chiral derivatization reagent，CDR）是被分析物先与高纯度的手性衍生试剂发生化学反应，生成非对映异构体缔合物，然后在HPLC色谱柱上进行分离的方法。L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸及其衍生物为氨基酸类衍生剂，适用于HPLC拆分胺类、醇类及羧酸类化合物，该类手性衍生试剂在氨基酸中的应用较为广泛，拆分效果也最好。在实际样品分析时，常常引入芳基，如邻苯二甲醛、苄酯及硝基苯等来提高样品的检测灵敏度。如在N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-D-青霉胺等光学纯硫醇存在的前提下，邻苯二甲醛能将胺类化合物转化为异吲哚类化合物，这一衍生反应被广泛用于氨基醇、氨基酸及胺的手性分离上。Nimura等[13]以邻苯二甲醛/N-乙酰基-L-半胱氨酸作手性衍生剂，在反相HPLC条件下，手性拆分氨基酸对映体，并应用于多种天然手性氨基酸的分离分析。
化学发光（CL）指的是化学反应的反应物（或生成物）吸收了反应所释放出来的化学能，电子从基态跃迁至激发态，再由激发态返回到基态时，产生的光发射现象。高能量、不放热、不做电功或其他功的化学反应释放能量，激发体系中某些化学物质分子而产生次级光发射，然后通过HPLC对样品产生的化学发光进行检测。化学发光试剂鲁米诺具有性质稳定，易于合成，发光效率高，水溶性好等优点，在HPLC-CL法中得到广泛应用。鲁米诺在碱性环境里，能和氧化剂发生氧化还原反应，生成激发态的中间产物，当中间产物返回基态时便会发出425 nm的蓝光[14]，通过测定化学发光强度，可测定出待测组分的含量。
3.1 化学发光条件的优化鲁米诺化学发光反应在碱性溶液中发生，本实验所选用流动相（甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液）为酸性溶液，因此需要优化鲁米诺溶液中氢氧化钠的浓度，得到最佳化学发光强度。鲁米诺作为发光试剂，其浓度是影响化学发光强度的重要因素之一，此外高锰酸钾对鲁米诺-高锰酸钾发光体系的影响较明显，因此本实验分别考察了氢氧化钠、鲁米诺、高锰酸钾的浓度对化学发光强度的影响，结果如图 1所示。由图可知，当氢氧化钠、鲁米诺和高锰酸钾的浓度分别为0.15、4.0×10-5和4.0×10-5 mol·L-1 时化学发光强度最大。
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反应条件（reaction conditions）：a.luminol，5.0×10-5 mol·L-1；KMnO4，1.0×10-4 mol·L-1 b.NaOH，0.15 mol·L-1；KMnO4，1.0×10-4 mol·L-1 c.NaOH，0.15 mol·L-1；luminol，4.0×10-4 mol·L-1 a.氢氧化钠（sodium hydroxide）b.鲁米诺（luminol）c.高锰酸钾（potassium permanganate） 图 1 3种物质的浓度变化对相对化学发光强度的影响 Figure 1 Effects of concentration changes of three substances on relative chemiluminescence intensity |
本实验选择由甲醇和0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液组成的流动相用于等度洗脱，考察了流动相配比对酪氨酸对映体手性分离的影响，见表 1。
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表 1 流动相配比对酪氨酸对映体手性分离的影响 Table 1 Effects of the volume fraction in mobile phase on chiral separation of Tyr enantiomers |
结果表明，保留时间和分离度随甲醇量的增加而降低，当甲醇量大于40%时，不能获得酪氨酸对映体的基线分离，还发现甲醇存在时可降低化学发光信号强度。考虑到分析时间、分辨率和甲醇量对化学发光信号的影响，选择甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（35:65，pH 6.0）用于进一步的优化研究。
3.2.2 流速和柱温考察了流速和柱温对酪氨酸对映体手性分离的影响，实验结果见表 2。
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表 2 流速和柱温对酪氨酸对映体手性分离的影响 Table 2 Effects of the flow rate and column temperature on chiral separation of Tyr enantiomers |
保持流动相组成及柱温（25 ℃）不变，在0.3~1.1 mL·min-1范围内考察流速对酪氨酸对映体手性分离的影响，由表 2可知，在0.3~1.1 mL·min-1范围内，随着流速的增加，酪氨酸对映体衍生物的分离度逐渐减小。当流速为0.7 mL·min-1时，对映体衍生物能得到很好的分离，但当流速增加到0.9 mL·min-1时，对映体便不能达到基线分离。因此，为了缩短分析时间并获得较好的分离效果，本实验选用0.7 mL·min-1作为流动相的最佳流速。
固定流速为0.7 mL·min-1，在其他色谱条件不变的情况下，考察了柱温在15~35 ℃范围内对酪氨酸对映体手性分离的影响，由表 2可知，柱温相对其他色谱条件对酪氨酸对映体手性分离的影响较小，由于25 ℃接近于室温，操作方便，便于控制，因此选用25 ℃。
由表 2可知，当流速为0.7 mL·min-1，柱温为25 ℃时满足分离要求。因此，选择甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（35:65，pH 6.0），流速为0.7 mL·min-1，柱温为25 ℃时为最合适的色谱条件。
3.3 酪氨酸对映体手性衍生色谱-化学发光联用色谱分析构建了手性衍生色谱-化学发光联用法，并首次用于酪氨酸对映体的分析。最佳色谱条件为甲醇-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（35:65，pH 6.0），流速为0.7 mL·min-1，最佳化学发光条件为氢氧化钠、鲁米诺和高锰酸钾的浓度分别为0.15、4.0×10-5和4.0×10-5 mol·L-1，在此最佳条件下对酪氨酸对映体进行联用分析，色谱图如图 2所示。
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1.L-Tyr 2.D-Tyr 图 2 鲁米诺-高锰酸钾的酪氨酸对映体色谱图 Figure 2 Tyr enantiomeric chromatogram of luminol-potassium permanganate |
图 2为酪氨酸对映体的手性衍生色谱-化学发光联用法色谱图，并在优化条件下进行方法学验证。由结果可知，手性衍生色谱-化学发光联用法对酪氨酸对映体的分离具有高灵敏度，在2.5×10-7~3.2×10-5 g·mL-1范围内呈良好的线性关系，对质量浓度为1.0×10-6 g·mL-1的酪氨酸对映体进行11次的平行测定，得RSD分别为0.92%（L-Tyr）、1.1%（D-Tyr）。根据IUPAC的建议，计算L-/D-酪氨酸的检测下限分别是2.96×10-8、3.59×10-8 g·mL-1，两者在该线性范围内可用于微量酪氨酸对映体的分析，也可用于生物样品中类似手性物质的测定分析。
3.4 生物样品中酪氨对映体的分析采用所建立的手性衍生色谱-化学发光联用法测定人和小鼠血浆中的D-/L-酪氨酸。为避免基质效应采用标准加入法进行定量，并以回收试验验证该方法的稳定性。精密量取人和小鼠血浆样品各100 μL，按“2.2”项下的步骤进行处理，并将血浆样品稀释一定倍数分别配制D-/L-酪氨对映体高、中、低3个浓度的样品，使其落在线性范围内进行测定，每一浓度采用6样本分析，分析结果列于表 3和表 4。由表 3和表 4实验结果可知，采用该方法测得生物样品中D-/L-酪氨酸对映体的平均回收率在93.5%以上，RSD均小于2.6%，该新方法具有准确、可靠，重现性好的优点，可用于微量D-/L-酪氨酸的测定，也可用于生物样品中类似手性物质的分析测定。
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表 3 人血浆样品中酪氨酸对映体的回收率（n=3） Table 3 The recoveries of Tyr enantiomers in human plasma samples |
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表 4 小鼠血浆样品中酪氨酸对映体的回收率（n=3） Table 4 The recoveries of Tyr enantiomers in mice plasma samples |
本文建立了一种新型酪氨酸对映体的手性衍生色谱-化学发光联用的分析方法，并用于体内酪氨酸对映体的检测。结果表明，该方法可以为酪氨酸对映体提供良好的分离（RS > 2.0）和高灵敏的检测（×10-8 g·mL-1），可成功应用于生物样品中酪氨酸对映体的分离和测定。该方法为临床上高效、灵敏的检测神经性疾病、肿瘤等的发展提供了理论依据。
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