2018, Vol. 38 
苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea（Thunb.）DC.或北苍术Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根茎，始载于《神农本草经》中，位列上品，具有燥湿健脾，祛风散寒，明目之功效，临床主要用于脘腹胀满，泄泻，水肿，脚气痿躄，风湿痹痛，风寒感冒，夜盲等症[1]。《名医别录》中记载其能“主头痛，消痰水，暖胃消谷嗜食”；现代药理研究表明，苍术具有抗炎、抗菌抗病毒、抗肿瘤、降糖、保肝以及抗心律失常等药理作用[2-7]。现行《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）中收录的苍术饮片有2种，分别为生苍术与麸炒苍术。传统中医药理论认为，苍术麸炒后健脾作用增强且燥性缓和。目前对于苍术麸炒机理的研究主要集中在化学成分、药理药效以及药代动力学等方面[8-14]，有关苍术炮制前后主要成分排泄动力学的研究未见报道。苍术苷A是苍术中的主要成分，为愈创木烷型倍半萜苷类化合物，于艳等[15]曾对苍术麸炒后其含量变化进行考察。本实验采用UPLC-MS/MS多反应离子对监测（MRM）法对苍术炮制前后苍术苷A的排泄动力学规律进行研究，明确苍术苷A在两者中的排泄差异，为苍术的炮制机理研究以及临床安全用药提供依据。
1 实验材料 1.1 实验动物SPF级健康SD雄性大鼠12只，体质量（200±20）g，购于辽宁长生生物技术有限公司，动物许可证编号[SYXK（辽）2013-0009]，适应性饲养1周后（湿度50%~60%，温度20~23 ℃，通风良好，光照适宜），进入实验状态。
1.2 样品与试剂苍术药材购自北京同仁堂大药房大连分店，经辽宁中医药大学鉴定教研室李峰教授鉴定为Atractylodes lancea（Thunb.）DC.，麸炒方法参考2015年版《中国药典》麸炒法附录ⅡD。药用乙醇（南京化学试剂股份有限公司）。苍术苷A、对乙酰氨基酚对照品（购于江苏永健医药科技有限公司，批号分别为YJ-1019PS0025、20160522，纯度均大于98%），结构式见图 1。色谱纯乙腈、色谱纯甲醇、色谱纯甲酸（购于美国TEDIA公司）。纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。
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图 1 苍术苷A（A）和对乙酰氨基酚（B）的结构式 Figure 1 Chemical structures of atractyloside A(A)and acetaminophen(B) |
Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪；Waters Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪（美国Waters公司）；Fresco台式冷冻离心机（德国Heraeus公司）；XH-C涡旋混合器（金坛市白塔新宝仪器厂）；氮吹仪（郑州宝晶电子科技有限公司）；Sartorius CP225D型电子天平（十万分之一，德国Sartorius公司）；旋转蒸发仪RE-52C（巩义市予华仪器有限责任公司）。
2 方法与结果 2.1 药材提取物的制备取同一批次生苍术和麸炒苍术药材饮片，粉碎成粗粉。分别称取粉末适量，加等倍量药用乙醇浸泡24 h，渗漉，收集10倍量渗漉液，减压浓缩，给药前加水适量分散均匀，备用。折合生药量均为2.5 g·mL-1，其中苍术苷A含量分别为2.08、1.82 mg·mL-1。
2.2 对照品溶液及内标溶液的制备 2.2.1 对照品溶液精密称取苍术苷A对照品适量，置50 mL量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，配成质量浓度为250μg·mL-1的对照品储备液，备用。临用前，用甲醇将对照品储备液稀释成高、中、低浓度分别为12.50、2.50、0.50μg·mL-1的对照品溶液。
2.2.2 内标溶液精密称取对乙酰氨基酚对照品适量，置100 mL量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，配成质量浓度为132μg·mL-1的内标物储备液。临用前，用甲醇稀释成0.07μg·mL-1的内标溶液。
2.3 色谱与质谱条件 2.3.1 色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~1.5 min，5%B→10%B；1.5~3 min，10%B→25%B；3~6 min，25%B→80%B；6~8 min，80%B）；流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；样品室温度：10 ℃；进样量：2μL。
2.3.2 质谱条件电喷雾离子源（ESI源），正离子模式，采用多反应监测模式（MRM）。电离电压：3.00 kV；去溶剂气温度：400 ℃；去溶剂气流速：800 L·h-1；核心气体流速：150 L·h-1；雾化气体压力：7 Pa。苍术苷A的MRM方法参数：离子对m/z 471.3 → 203.2，锥孔电压48 V，碰撞能量26 V，对乙酰氨基酚的MRM方法参数：离子对m/z 151.9 →110.16，锥孔电压42 V，碰撞能量14 V。质谱图如图 2所示。
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图 2 苍术苷A（A）和对乙酰氨基酚（B）的质谱图 Figure 2 Mass spectra of atractyloside A(A)and acetaminophen(B) |
将SD大鼠随机分为2组，每组6只，分别为生苍术组和麸炒苍术组。禁食（不禁水）12 h后，置于代谢笼中，收集空白尿液。分别按15 mL·kg-1灌胃给予生、麸炒苍术提取液，给药后按0~3、3~6、6~9、9~12、12~24、24~36、36~48、48~60、60~72 h收集尿液，准确记录尿液体积。将收集到的尿液于4 ℃、1 000 r·min-1离心10 min，取上清液作为尿液样品，-80 ℃保存。
2.4.2 样品的处理将尿液样品于室温下解冻，取解冻后尿液200μL，分别加入内标溶液100μL，甲醇900μL，涡旋混匀2 min，于4 ℃、1 000 r·min-1离心5 min，上清液氮气流下吹干，100μL甲醇复溶，涡旋2 min，4 ℃、1 200 r·min-1离心15 min，取上清液作为供试液。
2.5 方法学考察 2.5.1 方法专属性考察取大鼠空白尿液200μL，除不加内标溶液外，其余按“2.4.2”项下方法操作，得空白尿液供试液；另取大鼠空白尿液200μL，加入对照品溶液和内标溶液适量，其余按“2.4.2”项下方法操作，得含有对照品与内标物的尿液供试液；取灌胃给予苍术药材提取液后大鼠尿液200μL，按“2.4.2”项下方法操作，得给药后尿液供试液。将各组供试液按“2.3”项下条件进样分析，得色谱图。MRM图见图 3和图 4。
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1.苍术苷A（atractyloside A） A.空白尿液（blank urine）B.空白尿液+苍术苷A（blank urine + actractyloside A）C.给予苍术提取液后尿液（urine after administration of Atractylodes lancea extract） 图 3 苍术苷A的MRM模式通道图 Figure 3 Extracted ion chromatograms of atractyloside A under the model of MRM |
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1.对乙酰氨基酚（acetaminophen） A.空白尿液（blank urine）B.空白尿液+对乙酰氨基酚（blank urine + acetaminophen）C.给予苍术提取液后尿液（urine after administration of Atractylodes lancea extract） 图 4 对乙酰氨基酚的MRM模式通道图 Figure 4 Extracted ion chromatograms of acetaminophen under the model of MRM |
精密吸取对照品储备液适量，用甲醇稀释成含苍术苷A分别为25.00、12.50、5.00、2.50、1.00、0.50、0.20 μg·mL-1的系列对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各100μL，挥干溶剂后加入大鼠空白尿液200μL，按“2.4.2”项下方法操作，在“2.3”项下条件进样分析，每浓度三样本。以对照品与内标物峰面积的比值为纵坐标，对照品浓度为横坐标，以加权（1·C-2）最小二乘法进行回归计算，回归方程：
Y=0.271 93X+0.001 12 r=0.999
线性范围为0.20~25.00 μg·mL-1。检测下限为0.02 μg·mL-1，其RSD为6.4%。
2.5.3 基质效应和回收率考察取大鼠空白尿液200μL，加入甲醇1 000μL，涡旋2 min，4 ℃、1 000r·min-1离心5 min，上清液氮气流下吹干，残渣用100μL对照品溶液复溶，涡旋2 min，4 ℃、1 200 r·min-1离心15 min，取上清液，按“2.3”项下条件进样分析，高、中、低3种浓度各五样本，记录峰面积为A；精密吸取高、中、低3种浓度的对照品溶液100μL，每种浓度5份，挥干溶剂后加入大鼠空白尿液200μL，按“2.4.2”项下方法操作，“2.3”项下条件进样分析，记录峰面积为B；分别取相应的高、中、低3种浓度的对照品溶液，按“2.3”项下条件直接进样分析，每种浓度五样本，记录峰面积为C。A与C的比值为基质效应，B与A的比值为提取回收率，将B代入标准曲线回归方程，所得值与理论值的比值为方法回收率。内标溶液同法操作，即得内标物的基质效应和提取回收率，内标物只考察1个浓度即0.07 μg·mL-1。结果见表 1。由结果可知，待测物和内标物的基质效应均在92.2%~111.1%之间，提取回收率均大于81.4%，待测物方法回收率在97.9%~104.4%之间，符合生物样品定量分析方法的规定。
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表 1 基质效应和回收率试验结果（mean±SD，n=5） Table 1 Results of matrix effect and recovery |
精密吸取高、中、低3种浓度的对照品溶液100μL，每种浓度5份，挥干溶剂后加入大鼠空白尿液200μL，按“2.4.2”项下方法操作，在“2.3”项条件下进样分析。将待测物与内标物峰面积的比值代入随行标曲得实测浓度，由实测浓度计算得日内精密度，实测浓度与理论浓度的相对偏差即为准确度。连续测定3 d，得日间精密度与准确度。结果见表 2。由结果可知，苍术苷A的日内及日间精密度、准确度均符合生物样品定量分析方法的规定。
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表 2 精密度和准确度试验结果（mean±SD，n=5） Table 2 Results of precision and accuracy |
精密吸取高、中、低3种浓度的对照品溶液100μL，每种浓度5份，挥干溶剂后加入大鼠空白尿液200μL，按“2.4.2”项下方法操作，在“2.3”项条件下进样分析，分别考察室温放置6 h和-80 ℃反复冻融3次后的稳定性。结果见表 3。由结果可知，各组中苍术苷A实测值的RSD均在1.8%~4.6%之间，符合生物样品定量分析方法的规定。
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表 3 稳定性试验结果（mean±SD，n=5） Table 3 Results of stability |
将处理后的尿液样品按“2.3”项下条件进样分析，采用DAS 3.2.8软件非静脉注射给药方式的尿药分析模式计算尿排泄动力学参数，采用Spss 17.0软件进行单因素方差分析，数据结果见表 4和表 5。排泄速率-时间曲线和累计排泄量-时间曲线见图 5和图 6。
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表 4 生、麸炒苍术中苍术苷A的排泄结果（mean±SD，n=6） Table 4 Excretion results of atractyloside A in crude and processed Atractylodes lancea |
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表 5 生、麸炒苍术中苍术苷A的尿排泄动力学参数（mean±SD，n=6） Table 5 Excretion parameters of atractyloside Ain crude and processed Atractylodes lancea |
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图 5 排泄速率-时间曲线 Figure 5 Curves of excretion velocity-time |
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图 6 累积排泄率-时间曲线 Figure 6 Curves of cumulative excretion rate-time |
由表 5可知，生、麸炒苍术中苍术苷A的排泄动力学参数t1/2和ke均无统计学差异，表明麸炒对苍术苷A的尿排泄动力学规律无明显影响。但对比尿排总量和总尿排率可知，麸炒后苍术苷A 72 h的总排泄量和总排泄率均明显大于生品，结果具统计学意义（P < 0.05，P < 0.01）。由排泄速率-时间曲线可知，大鼠灌胃给予生、麸炒苍术提取物后其主要成分苍术苷A的尿排泄速率均可在3 h达到最大值，且麸炒后明显大于生品，此后排泄速率逐渐下降。由累计排泄率-时间曲线可知，给药后的24 h内苍术苷A的累计排泄率均上升较快，且于36 h时基本可达平台期，生苍术和麸炒苍术灌胃后苍术苷A 36 h累积排泄量即可达到总排泄量的88.55%和90.34%。
3 讨论采用UPLC-MS/MS多反应监测模式，建立了生、麸炒苍术给药后大鼠尿液中苍术苷A的浓度测定方法，该方法稳定性好，重复性高，符合生物样品定量分析的规定，可用于苍术苷A的排泄动力学研究。
课题组早期曾对苍术炮制前后主要成分苍术素和（4E，6E，12E）-十四癸三烯-8，10-二炔-1，3-二乙酸酯的药代动力学以及组织分布规律进行研究[16-18]，结果初步显示苍术炮制后体内吸收有所增加。本实验中，生、麸炒苍术提取物均按折合后相同的生药量灌胃给药，其中生、麸炒苍术提取物中苍术苷A的浓度分别为2.08、1.82 mg·mL-1（麸炒后浓度略有降低），但麸炒后苍术苷A的尿总排泄量却明显大于生品。结合苍术苷A前期的药代动力学结果，麸炒后血药浓度有所升高，推测该变化亦有可能与麸炒后苍术苷A的体内吸收增加有关。
生、麸炒苍术给药后72 h大鼠尿液中苍术苷A的累积排泄量分别为给药量的0.21%和0.26%，说明苍术苷A仅有小部分以原形形式通过尿液排泄，进而表明苍术苷A在体内可能存在吸收和转化，以代谢物或其他形式排出体外。
对比苍术麸炒前后苍术苷A的排泄动力学差异，可为苍术的炮制机理研究以及临床安全用药提供一定依据。由于机体的代谢过程复杂，且苍术中化学成分种类繁多，对单一成分的研究很难阐述整体的排泄规律，为进一步阐明炮制机理，还需对苍术中其他成分的排泄规律进行深入的研究。
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