2018, Vol. 38 
C1酯酶抑制剂（C1 esterase inhibitor，C1INH）是1957年在血浆中发现的热敏感物质，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpins）超家族[1-3]。人的C1INH是由肝脏细胞合成并存在于血浆中的糖蛋白，在调控血管稳态中具有重要的作用。C1INH主要抑制补体级联（C1s、C1r和MASP2）、接触激活途径（激肽释放酶和凝血因子ⅩⅡa）、内源性凝血酶（凝血因子ⅩⅠa）和纤溶蛋白酶（血纤维蛋白溶酶和组织纤溶酶原激活物）的活性[3-7]。当C1INH基因缺陷/变异、C1INH缺乏或功能降低时，补体和接触激活途径被激活，不能充分地抑制接触激活途径，从而引起缓激肽的上调表达，最终导致皮肤和粘膜部位血管内容物渗出，形成局部水肿，这是引起遗传性血管性水肿（Hereditary Angioedema，HAE）的直接原因[4-5]。HAE是致命的，国际上推荐C1INH浓缩剂为HAE患者急性发作的首选治疗方案[8-10]。
目前，美国或欧洲批准上市的C1INH主要是血浆来源的Berinert、Cetor、Cinryze、Haegarda浓缩制剂和分泌自转基因兔乳汁中的重组人C1酯酶抑制剂（recombinant human C1 esterase inhibitor，rhC1INH）类似物Ruconest。Ruconest于2010年和2014年分别在欧盟和美国获准上市，适用于成人和青少年HAE患者急性发作的治疗[9-14]。家兔乳汁纯化后的rhC1INH为单体结构，相对分子质量（约98 k）和糖基化程度均低于天然C1INH，抑制活性与血浆来源的C1INH一致[11, 14-15]。
2015年10月，欧洲药典首次收录了人血浆来源C1INH的质量控制标准[11]。尽管rhC1INH已经在欧盟和美国上市，药典并没有纳入其质量控制标准，更没有聚合物的检测方法和限度要求。聚合物与药物的结构相同，其形成可以发生在生产/纯化工艺、存储、运输等过程中，二硫键、疏水性、pH、离子强度、表面活性剂和温度等条件的改变是蛋白质聚合的诱因。聚合物能够影响药物的生物活性、体内药代动力学和免疫原性，引起机体的免疫反应，最终可能会影响药物的有效性和安全性[16-18]。因此，在重组蛋白药物的质量控制中，研究者要建立合适的分析方法对聚合物进行鉴别，并确定产品中聚合物的限度，确保药物的安全性和有效性[17]。
本研究建立了rhC1INH聚合物含量的分子排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）测定方法，并对4批次成品进行测定，为rhC1INH聚合物的质量控制提供了重要的依据。
1 仪器与试药高效液相色谱仪（Waters，2659分离器，2487/2489紫外检测器，Empower工作站）；TSK GEL3000SW色谱柱（TOSOH，5 μm，7.8 mm×300 mm）。
rhC1INH对照品（科室留存）；凝胶过滤对照品（Biorad，151-1901）；流动相（250 mmol·L-1磷酸缓冲液，pH 6.8）；超纯水（Millipore，Mili-Q Advantage超纯水系统）。
4批次rhC1INH样品（S1、S2、S3和S4，科室留存，其中S1用于SEC-HPLC方法学验证）。
2 方法 2.1 溶液制备 2.1.1 rhC1INH对照品溶液取1瓶rhC1INH对照品，用流动相稀释至0.1 mg·mL-1，分别制备质量浓度为25.0、35.0、45.0、55.0、65.0、75.0和85.0 μg·mL-1的对照品溶液。
2.1.2 系统适用性溶液取1瓶凝胶过滤对照品，加入1.0 mL超纯水，充分混匀后，取15.0 μL溶液加入至585.0 μL流动相，充分混匀后备用。
2.1.3 rhC1INH供试品溶液取1瓶rhC1INH样品，用14.0 mL超纯水充分溶解，再用流动相稀释至6.0 mg·mL-1。同时，以流动相作为空白对照。
2.2 色谱条件TSK GEL3000SW色谱柱（TOSOH，5 μm，7.8 mm×300 mm）；采用250 mmol·L-1的磷酸缓冲液（pH 6.8）流动相进行等度洗脱，运行时间为45 min，流速0.5 mL·min-1；检测波长214 nm；柱温20~25 ℃；进样量20 μL。
2.3 数据分析用面积归一化法计算rhC1INH中聚合物的含量，即聚合物峰面积占除溶剂峰以外的总色谱峰面积的百分率。
3 结果 3.1 系统适用性试验系统适用性试验色谱图见图 1。空白对照样品中出现溶剂峰（图 1-A）；图 1-B中，γ球蛋白（峰4）和卵清蛋白（峰5）之间的分离度（Rs）为2.7（RSD为3.1%）；肌球蛋白（峰6）的理论塔板数（N）为19 367（RSD为2.4%），说明柱效和该方法的分离度较好。图 1-D为rhC1INH样品的色谱图，除rhC1INH的主峰（峰4）外，还分离到3个聚合物峰（峰1~3）。峰5及其肩峰是rhC1INH中低分子量相关蛋白，峰6是制剂缓冲液中的柠檬酸盐组分。本研究只对峰1~3聚合物进行分析。
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A.空白对照（blank control）B.凝胶过滤标准品（gel filtration standard）C. rhC1INH对照品（rhC1INH reference substance）D. rhC1INH样品（rhC1INH sample） 图 1 SEC-HPLC色谱图 Figure 1 Chromatograms of SEC-HPLC |
rhC1INH对照品的色谱图结果见图 1-C。以对照品浓度为横坐标（X），主峰的峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归分析，回归方程：
| $ Y = 2.972 \times {10^7}X - 2.11 \times {10^5}\;\;\;\;\;\;\;{R^2} = 0.998 $ |
重复3次试验的回归系数R2分别为0.998、0.997和0.995（均值为0.997，RSD为0.16%），说明在25.0~85.0 μg·mL-1范围内，对照品浓度与峰面积之间呈现良好的线性关系。
3.3 精密度分析取S1批rhC1INH样品进行6次色谱分析，分别计算样品中单组份聚合物（峰1~3）和总聚合物的面积占总峰面积的百分率。如表 1所示，S1样品中总聚合物的平均含量为0.86%，RSD为4.8%；峰3聚合物的RSD为3.9%，峰2和峰1聚合物的RSD分别为9.0%和10.7%。同时，S1样品中主要C1INH成分的含量为98.22%，RSD为0.04%。说明该方法的精密度较好。另外，rhC1INH中聚合物成分（峰3）的Rs为1.8（＞1.5），可保证主成分与该聚合物完全有效分离。峰3与峰2、峰2与峰1相关蛋白成分的Rs均＜1.0，其中峰2和峰1的分离效果最差。rhC1INH主成分含量的RSD明显低于峰3、峰2和峰1的RSD。
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表 1 RhC1INH中聚合物含量及分离度的分析结果 Table 1 The results of total aggregates and Rs in rhC1INH |
取S1样品，每2 h进样1次，共进样4次，样品中总聚合物的含量分别为0.70%、0.77%、0.75%和0.76%，平均值为0.75%，RSD为4.2%，表明在检测条件下，S1样品在6 h内的稳定性良好。
3.5 方法应用按照“2.2”项色谱条件，对S1、S2、S3和S4批次成品进行色谱分析（每批样品重复测定3次）。4批rhC1INH均检出聚合物，其中总聚合物的含量分别为0.82%、1.01%、0.97%和0.92%（表 2）。
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表 2 RhC1INH中总聚合物含量 Table 2 The total aggregates in rhC1INH |
在生物技术药物的研发及生产中，质量控制是确保药物安全性和有效性的重要手段，其中工艺相关杂质和产品相关杂质/蛋白的鉴定是必不可少的常规检测项目[17]。rhC1INH来源于转基因家兔的乳汁，产品中的相关杂质/蛋白是在生产、纯化等过程中产生的与主要蛋白结构类似的同系物、异构体、突变物、氧化物、聚合体或降解物，本研究主要对rhC1INH产品中的聚合物进行研究。聚合物的产生机制主要是疏水结构域间的相互作用或二硫键的形成等[19]。C1INH的N端含有独特的116个氨基酸残基，主要通过2对二硫键与丝氨酸蛋白酶结构域相连[2, 20]。二硫键在稳定C1INH结构和保持丝氨酸蛋白酶抑制剂活性中具有重要的作用，破坏二硫键的结构会导致C1INH构象的改变、活性的丧失和蛋白的多聚化[2-3, 21]。因此，合格的rhC1INH产品应该保持正确的二硫键构象，并将蛋白聚合物的含量控制在最小范围[10]。
目前，重组蛋白药物中聚合物的检测方法主要包括SDS-PAGE、SEC（包含多种检测器的不同方法）和质谱等方法，其中SEC-HPLC是目前用于分析聚合物含量的标准方法[16-18, 22]。对rhC1INH而言，国内外药典中均无聚合物的检测方法及限度要求，本研究针对rhC1INH中聚合物建立了SEC-HPLC检测方法。从SEC-HPLC色谱结果可以看出（图 1-D）：rhC1INH主成分洗脱峰（峰4）前存在3个蛋白峰（峰1-峰3），3个蛋白峰的含量明显低于rhC1INH主成分峰；在分离度方面，峰3与rhC1INH主成分峰能够有效分离；峰3和峰2、峰2和峰1不能获得较好的分离效果，但能保证峰2、峰1与主成分峰4有较好的分离度。本研究对rhC1INH中的总聚合物含量进行分析，结果显示：4批次rhC1INH样品中的主要蛋白平均纯度为98.3%，平均洗脱时间为14.8 min；总聚合物的含量约为0.82%~1.01%。在Feussner等[9]的研究中，13.5 min洗脱时间之前的蛋白成分认定为聚集体和其他高分子量蛋白，约占0.6%。本文与Feussner研究的差异可能与SEC-HPLC条件（流动相成分和pH等）和产品批次差异有关；另外，保存条件和保存时间也会影响rhC1INH中聚合物的含量。在下一步的研究中，我们需要分别收集3个聚合物成分，采用SDS-PAGE、动态光散射、粘度计和折射计等多重高效分子排阻色谱方法进行更深入的分析，以鉴定峰3、峰2和峰1相关蛋白的聚合物形式。
综上所述，本研究建立了rhC1INH产品中聚合物含量的检测方法，鉴于聚合物可能产生的免疫原性和副反应，应尽可能减少C1INH制剂中蛋白聚集物的含量，并控制在可接受的限度范围内。
| [1] |
RATNOFF OD, LEPOW IH. Some properties of an esterase derived from preparations of the first component of complement[J]. J Exp Med, 1957, 106(2): 327. DOI:10.1084/jem.106.2.327 |
| [2] |
BOCK SC, SKRIVER K, NIELSEN E, et al. Human C1 inhibitor:primary structure, cDNA cloning, and chromosomal localization[J]. Biochemistry, 1986, 25(15): 4292. DOI:10.1021/bi00363a018 |
| [3] |
LAMARK T, INGEBRIGTSEN M, BJORNSTAD C, et al. Expression of active human C1 inhibitor serpin domain in Escherichia coli[J]. Protein Expr Purif, 2001, 22(2): 349. DOI:10.1006/prep.2001.1445 |
| [4] |
BEINROHR L, HARMAT V, DOBO J, et al. C1 inhibitor serpin domain structure reveals the likely mechanism of heparin potentiation and conformational disease[J]. J Biol Chem, 2007, 282(29): 21100. DOI:10.1074/jbc.M700841200 |
| [5] |
BORK K, STEFFENSEN IMACHNIG T. Treatment with C1-esterase inhibitor concentrate in type Ⅰ or Ⅱ hereditary angioedema:a systematic literature review[J]. Allergy Asthma Proc, 2013, 34(4): 312. DOI:10.2500/aap.2013.34.3677 |
| [6] |
BERNSTEIN JA, RITCHIE B, LEVY RJ, et al. Population pharmacokinetics of plasma-derived C1 esterase inhibitor concentrate used to treat acute hereditary angioedema attacks[J]. Ann Allergy Asthma Immunol, 2010, 105(2): 149. DOI:10.1016/j.anai.2010.06.005 |
| [7] |
DAVIS AE, MEJIA PLU F. Biological activities of C1 inhibitor[J]. Mol Immunol, 2008, 45(16): 4057. DOI:10.1016/j.molimm.2008.06.028 |
| [8] |
AZZAM R, BOUTROS J, IRANI C. Hereditary angioedema:a literature review and national management guidelines[J]. J Med Liban, 2015, 63(2): 97. |
| [9] |
FEUSSNER A, KALINA U, HOFMANN P, et al. Biochemical comparison of four commercially available C1 esterase inhibitor concentrates for treatment of hereditary angioedema[J]. Transfusion, 2014, 54(10): 2566. DOI:10.1111/trf.2014.54.issue-10 |
| [10] |
BORK K. Pasteurized and nanofiltered, plasma-derived C1 esterase inhibitor concentrate for the treatment of hereditary angioedema[J]. Immunotherapy, 2014, 6(5): 533. DOI:10.2217/imt.14.33 |
| [11] |
汪菲菲, 李策生. 人C1酯酶抑制剂的研究进展[J]. 中国生物制品学杂志, 2017, 30(11): 1227. WANG FF, LI CS. Progress in research on C1 esterase inhibitor[J]. Chin J Biologicals, 2017, 30(11): 1227. |
| [12] |
GUPTA R, BALDUZZI J, DAVIS-LORTON M. C1-esterase inhibitor(Cinryze®) use in the treatment of pediatric hereditary angioedema[J]. Immunotherapy, 2018, 10(8): 635. DOI:10.2217/imt-2017-0049 |
| [13] |
GOLDENBERG MM. Pharmaceutical approval update[J]. P&T, 2014, 39(9): 619. |
| [14] |
CRUZ MP. Conestat alfa(ruconest):first recombinant c1 esterase inhibitor for the treatment of acute attacks in patients with hereditary angioedema[J]. P&T, 2015, 40(2): 109. |
| [15] |
KESIK-BRODACKA M. Progress in biopharmaceutical development[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2017, 65(2): 306. |
| [16] |
韦薇, 罗建辉, 尹红章, 等. 重组单克隆抗体相关物质和相关杂质的研究与评价[J]. 中国新药杂志, 2014, 23(8): 906. WEI W, LUO JH, YIN HZ, et al. Comments on development and assessment of the drug impurities and substances related to recombinant monoclonal antibodies[J]. Chin J New Drugs, 2014, 23(8): 906. |
| [17] |
任彬, 潘勇兵, 邹汉武. 重组蛋白质药物相关杂质检测方法的分析与评价[J]. 中国生物制品学杂志, 2016, 29(1): 104. REN B, PAN YB, ZOU HW. Analysis and evaluation of method for determination of impurites in recombinat protein durgs[J]. Chin J Biologicals, 2016, 29(1): 104. |
| [18] |
KHODABANDEHLOO A, CHEN DD. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals[J]. Bioanalysis, 2017, 9(3): 313. DOI:10.4155/bio-2016-0269 |
| [19] |
JENKINS N, MURPHY L, TYTHER R. Post-translational modifications of recombinant proteins:significance for biopharmaceuticals[J]. Mol Biotechnol, 2008, 39(2): 113. DOI:10.1007/s12033-008-9049-4 |
| [20] |
WAGENAAR-BOS IG, HACK CE. Structure and function of C1-inhibitor[J]. Immunol Allergy Clin North Am, 2006, 26(4): 615. DOI:10.1016/j.iac.2006.08.004 |
| [21] |
BOS IG, LUBBERS YT, ROEM D, et al. The functional integrity of the serpin domain of C1-inhibitor depends on the unique N-terminal domain, as revealed by a pathological mutant[J]. J Biol Chem, 2003, 278(32): 29463. DOI:10.1074/jbc.M302977200 |
| [22] |
FEKETE S, BECK A, VEUTHEY JL, et al. Theory and practice of size exclusion chromatography for the analysis of protein aggregates[J]. J Pharm Biomed Anal, 2014, 101: 161. DOI:10.1016/j.jpba.2014.04.011 |