2018, Vol. 38 
遗传性血管水肿（hereditary angioedema，HAE）是一种罕见的常染色体显性遗传病，临床表现为反复的皮肤及粘膜下水肿，累及呼吸道和胃肠道，尽管发病率仅为1/10 000~1/15 000，但当呼吸道受累时，易诱发窒息，死亡率极高。其分子机制为C1酯酶抑制剂（C1 esterase inhibitor，C1INH）编码基因突变，导致人体内C1INH缺乏或功能缺陷，从而致病，因此又称为遗传性C1抑制物缺乏症[1-2]。
C1INH由478个氨基酸残基组成，蛋白质成分占51%[3]，是1种高度糖基化的单链糖蛋白，属于serpin超家族中的1种丝氨酸蛋白酶抑制剂，是四大血浆级联系统的中心调节物质[4-7]。人体内缓激肽的积累会导致血管内容物渗出，形成局部水肿，从而诱发HAE[8-10]。重组人C1INH（rhC1INH）是由转基因兔分泌兔奶生产的人C1INH类似物，其糖基化程度低于人C1INH，rhC1INH可通过抑制激肽释放酶与活化的凝血因子Ⅻ（FⅫa）的活性，抑制缓激肽的形成[6]，从而达到治疗HAE的效果。
天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）的脱酰胺作用或天冬酰胺残基的异构化可发生在生产或长期保存的蛋白中，可能导致蛋白活性下降[11-12]，而Gln的脱酰胺速率远低于Asn[13]，因此，脱酰胺作用的程度可由蛋白中形成的异天冬氨酸（IsoAsp）的浓度反映[14]。IsoAsp的形成影响rhC1INH制品的有效性和稳定性，因此，需要对IsoAsp的含量进行质量控制。
本研究采用异天冬氨酸甲基转移酶（PIMT）催化结合反相高效液相色谱（RP-HPLC）技术，建立了针对rhC1INH制品中IsoAsp的质量控制方法。PIMT可将IsoAsp转化为异天冬氨酸甲酯，此反应中PIMT催化甲基从底物S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）转移至IsoAsp，进而释放S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH）（图 1）。利用外标校正法检测SAH的浓度，进而间接检测IsoAsp的浓度，最后，用所建方法对3批rhC1INH制品中的IsoAsp含量进行检测。
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图 1 SAM在PIMT催化下脱甲基示意图 Figure 1 Diagram of demethylation of SAM catalyzed by PIMT |
HPLC色谱仪（Waters 2659分离器，2487/2489紫外检测器，Empower工作站）；Vydac蛋白保护柱（货号218GK52）；蛋白质/肽C18分析柱（Grace Vydac，2.1 mm×250 mm，5 μm）；离心机，涡旋仪，水浴锅等。
异天冬氨酸检测试剂盒[包含有IsoAsp-DSIP标准品（DSIP，Delta-Sleep Inducing Peptide，δ睡眠诱导肽）、反应缓冲液、SAM标准品、SAH标准品、PIMT及相应稀释液]（Promega，MA1010）；三氟乙酸（TFA）（分析纯，Aladdin）；乙腈（色谱纯，Merk）；胃蛋白酶为分析纯。
4批rhC1INH样品（S1，S2，S3和S4，科室留存）；rhC1INH标准品（40 mg·mL-1），科室留存。
2 方法与结果 2.1 溶液的配制 2.1.1 0.1 mol·L-1 Gly/HCl溶液pH 2.0：含7.5 mg·mL-1甘氨酸（Gly）的水溶液，以3 mol·L-1 HCl溶液调pH至2.0。
2.1.2 胃蛋白酶溶液取胃蛋白酶适量，加0.075 mol·L-1 HCl溶液溶解并制成每1 mL约含0.5 mg胃蛋白酶的溶液。
2.1.3 Master mix每个反应体系对应的Master mix配方为：水10μL +反应缓冲液10μL+0.15 mmol·L-1 SAM 10μL + PIMT 10μL，冰上配制，轻轻混匀。
2.1.4 供试品溶液和rhC1INH标准品的预处理用“2.1.1”项所配0.1 mol·L-1 Gly/HCl溶液，分别将供试品和rhC1INH标准品稀释至19.0 mg·mL-1。
2.2 酶反应酶反应共分2步进行：第一步是胃蛋白酶消化，以避免蛋白在PIMT反应中IsoAsp位点可能发生的位阻效应；第二步是PIMT反应，由PIMT催化，将甲基从底物SAM转移至IsoAsp，并释放出SAH。第一步：取“2.1.4”项预处理的供试品溶液和rhC1INH标准品溶液各10 μL，分别加入0.1 mol·L-1 Gly/HCl溶液38 μL和胃蛋白酶溶液3 μL，总体积为51 μL，供试品和rhC1INH标准品的浓度为3.73μg·μL-1，同时取超纯水以同样体系处理，作为阴性对照，将各反应体系混匀后，在37℃孵育120 min；第二步：从经过第一步消化的反应体系中，各取10 μL，分别加入Master mix 40 μL，在30℃孵育30 min后，分别加入0.3 mol·L-1磷酸溶液10 μL终止反应，15 000 g离心5 min，各吸取60 μL加入液相小瓶，供试品和rhC1INH标准品的终浓度为0.622μg·μL-1。同时取3.0 μmol·L-1的IsoAsp-DSIP（按试剂盒说明稀释）10 μL，以同样步骤处理，用作系统适用性考察指标（PRC溶液）。以超纯水为空白，准备进行液相色谱分析。
2.3 色谱条件采用带有Vydac保护柱的Vydac蛋白质/肽C18分析柱；柱温30 ℃；检测波长260 nm；进样量20 μL；流速0.3 mL ·min-1；用流动相A（0.2% TFA的水溶液）和B（1 mL TFA，475 mL乙腈，25 mL水）梯度洗脱[0~15 min，A-B（100：0）；15~18 min，A-B（100：0）→（0：100）；18~23 min，A-B（0：100）；23~26 min，A-B（0：100）→（100：0）；26~46 min，A-B（100：0）]。
2.4 SAH标准曲线的绘制将异天冬氨酸检测试剂盒中的SAH稀释至5、10、15、20、30、40、50、60 pmol/60 μL，按“2.3”项色谱条件检测SAH，以SAH峰面积（Y）对SAH浓度（X）绘制标准曲线，用于后续试验计算SAH浓度，进而得到IsoAsp浓度。本次试验的标准曲线：
| $ Y = 335.1X - 1\;960.9\;\;\;\;{R^2} = 0.996 $ |
标准浓度为10、15、20、30、40、50、60 pmol/ 60 μL的SAH的检测峰面积，经标准曲线公式计算得到对应的SAH检测浓度，分别为9.54、13.79、21.72、29.65、41.42、49.09、59.79 pmol/60 μL，分别为标准浓度的95.4%、91.9%、108.6%、98.8%、103.6%、98.2%、99.7%，均在标准浓度的90%~110%范围内。
2.5 系统适用性取PRC溶液，按“2.3”项色谱条件检测SAH和PIMT，重复2次。如图 2所示，PIMT的保留时间约在10 min，PIMT峰的容量因子（k′）=8.94，峰面积为2.55×104 μV×s，拖尾因子（T）=1.43，塔板数为3.57×103；SAH的保留时间约在14 min，SAH峰的容量因子（k′）=13.09，峰面积为1.87×104 μV×s，拖尾因子（T）=1.08，塔板数为2.42×103；PIMT峰和SAH峰的分离度（Rs）=4.61。
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图 2 酶处理后的IsoAsp-DSIP色谱图 Figure 2 Chromatogram of IsoAsp-DSIP after enzyme treatment |
将经“2.2”项酶处理后的rhC1INH标准品，按“2.3”色谱条件检测SAH含量（即IsoAsp含量）。标准曲线：
| $ Y = 335.1X - 1\;960.9\;\;\;{R^2} = 0.996 $ |
结果如图 3所示，PIMT和SAH的保留时间分别在9.89 min和13.98 min，两者之间的分离度Rs=4.8，rhC1INH标准品中IsoAsp的含量为0.3 μmol IsoAsp/g rhC1INH。
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图 3 酶处理后的rhC1INH标准品色谱图 Figure 3 Chromatogram of rhC1INH reference substance after enzyme treatment |
将异天冬氨酸检测试剂盒中的SAH稀释至10、30、60 pmol/60 μL 3个浓度（QC1，QC2，QC3），按“2.3”项色谱条件检测SAH，每个浓度检测3次。根据标准曲线计算SAH的检测浓度。结果见表 1，SAH的检测浓度均在标准浓度的90%~110%范围内，表明该方法的准确性较好。
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表 1 回收率试验结果（n=3） Table 1 The test results of recovery |
在1批供试品（供试品S1）中取3支样品，每个样品按“2.2”项酶处理后，以“2.3”项色谱条件测定3次，取SAH峰面积均值作为1次试验结果，以当次试验标准曲线方程计算SAH含量（即IsoAsp含量），对试验的精密度进行验证（图 4）。结果如表 2所示，该批供试品中，IsoAsp含量为0.413μmol IsoAsp/g rhC1INH，RSD为4.8%，显示了较好的精密度。
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图 4 1批供试品中IsoAsp含量的检测 Figure 4 Content determination for IsoAsp of 1 batch of test sample |
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表 2 精密度试验结果 Table 2 The test result of precision |
分别将另外3批供试品（供试品S2、S3、S4）按“2.2”项酶处理后，以“2.3”项色谱条件进行检测。重复测定3次，用该次试验标准曲线方程计算3批供试品中IsoAsp的含量。本次试验的标准曲线方程：Y=800.3X-4 333.1（R2=0.995），结果如表 3所示。供试品S2、S3和S4中，IsoAsp的含量分别为0.633、0.827和0.487μmol IsoAsp/g rhC1INH。
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表 3 3批供试品中IsoAsp的含量测定 Table 3 Content determination for IsoAsp of 3 batches of test samples |
由于对安全性和有效性的影响，治疗性蛋白的化学稳定性是需要重点关注的问题之一。对氨基酸残基的各种化学修饰是影响蛋白化学稳定性的主要因素，其中包括脱酰胺基化、糖基化、氧化等。脱酰胺可发生在Asn残基和Gln残基上，由于Gln脱酰胺发生的速率比Asn[15-16]慢很多，因此关注的重点一般都在Asn的脱酰胺作用上。Asn非酶催化的脱酰胺化主要有2种模式：1种是在酸性环境中直接水解，另1种是在pH 5~12环境下，Asn C末端骨架上的氮原子对Asn侧链酰胺基上的碳原子进行亲核攻击，形成1个闭合环的琥珀酰亚胺残基中间体，琥珀酰亚胺残基快速水解，得到天冬氨酸（Asp）或IsoAsp[17]（见图 5）。蛋白制品中天冬酰胺残基的脱酰胺化是蛋白降解的主要原因之一[18]，因此，在蛋白制品中，对蛋白脱酰胺化的检测是研究蛋白稳定性、安全性和有效性的重要组成部分。
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图 5 蛋白脱酰胺示意图 Figure 5 Schematic diagram of protein deamidating |
对脱酰胺反应的检测一般采用对脱酰胺位点的识别和对脱酰胺产物IsoAsp的检测2种方式[19]。对脱酰胺位点的识别一般采用高效液相色谱串联质谱的方式，在用高效液相色谱分离脱酰胺前后的多肽后，以质谱技术检测脱酰胺位点[12]。本试验采用对脱酰胺产物IsoAsp检测的方式，在经过PIMT催化后，对生成的SAH进行检测，进而得到蛋白制品C1INH中IsoAsp的定量结果。该方法有较好的专属性、准确性和精密度，且易于操作，适用于C1INH在生产和储存过程中的常规检验，可为该制品的稳定性、安全性和有效性及储存工艺研究提供重要的试验依据。
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