重组人干扰素α-2是一种通过工程化大肠杆菌表达系统表达后，经纯化制备的产品，用于治疗恶性肿瘤、亚急性重症肝炎、肝纤维化（早期肝硬化）、感染与损伤性疾病、骨髓增生异常综合症、病毒性疾病、系统性硬皮病、异位性皮炎、风湿性关节炎等症^[1-3]。人干扰素α-2包括α-2a和α-2b，两者氨基酸序列相似，只是在第23位，人干扰素α-2a为赖氨酸残基，而α-2b为精氨酸残基。重组人干扰素α-2作为重组蛋白药物，很容易在生产或储存阶段由于某些氨基酸的氧化、脱酰胺、肽链断裂、蛋白水解、聚集和错误折叠等原因，产生多种蛋白变异体，即重组人干扰素α-2的制品相关蛋白^[4-6]。这些相关蛋白与天然蛋白相比，结构已发生变化，并可能带来一些不良后果：生物活性下降；药代动力学特性发生改变；免疫原性改变从而产生不希望的免疫反应等^[7-10]。因此，制品相关蛋白的产生可能导致产品质量下降，对其进行分析和控制是重组蛋白药物质量控制的重要项目^[11-13]。欧洲药典（EP）采用反相HPLC方法对干扰素α-2产品相关蛋白进行分析^[14-15]。但是在现行版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）中，重组人干扰素α-2a/2b的质量标准不包含该项目的检测^[16]。本研究拟采用EP的干扰素α-2相关蛋白分析方法，对国内不同厂家生产的产品进行检测，为提高干扰素产品的药典标准，即增加制品相关蛋白检测项目提供实验数据支持，从而为进一步提高国内干扰素的产品质量奠定基础。

仪器：Waters 2695型液相色谱仪；Waters 2489型紫外检测器；Waters Empower数据分析软件。三氟乙酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。20批重组人干扰素α-2原液获自7家生产企业（A~G）。

分别取适量来源于7家生产企业的20批重组人干扰素α-2原液，用注射用水稀释至1 mg·mL^-1，混匀，作为供试品溶液。

取一定量的其中1份供试品溶液（D厂家），加入适量的0.25%过氧化氢溶液，使过氧化氢终浓度为0.05%，室温放置1 h或能够生成5%氧化干扰素的时间。每1 mL溶液中加入L-甲硫氨酸12.5 mg，室温放置1 h，在2~8 ℃储存不超过24 h。

色谱柱：Agilent Zorbax 300SB-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.0 mL·min^-1；柱温：室温，进样体积：50 μL；检测波长：210 nm。流动相：流动相A为0.2%三氟醋酸+30%乙腈溶液，流动相B为0.2%三氟醋酸+80%乙腈溶液。线性洗脱梯度程序：0 min，28%B；1 min，28%B；5 min，33%B；20 min，37%B；30 min，43%B；40 min，60%B；42 min，60%B；50 min；28%B。供试品溶液和参比溶液各进样1次。采集60 min数据，并处理色谱信息，打印报告。

供试品图谱中干扰素α-2的保留时间约20 min；参比溶液图谱中氧化干扰素α-2的保留时间为主峰的0.9倍，氧化干扰素α-2与主峰的分离度应不小于1.0。按面积归一化法计算，在主峰保留时间的0.7至1.4之间积分，供试品单个相关蛋白洗脱峰积分面积应不高于总积分面积的3.0%，总的相关蛋白洗脱峰积分面积应不高于总积分面积的5.0%。

在对参比品溶液的分析中，干扰素α-2的保留时间为20.7 min，参比溶液图谱中氧化干扰素α-2的保留时间为主峰的0.9倍，干扰素峰和氧化干扰素峰的分辨率为2.4，系统适用性符合要求（见图 1）。

A.参比溶液（D企业）（reference solution，manufacturer D）B. A企业（manufacturer A）C. E企业（manufacturer E）D. G企业（manufacturer G） 图 1 重组人干扰素α-2b产品色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of interferon-α-2b produced

对7家企业生产的20批重组人干扰素α-2原液进行制品相关蛋白的含量分析，结果见表 1。经过检测分析，其中A、B、C、D和G 5家企业的16批产品符合规定，E和F 2家企业的4批产品不符合规定。20批产品的制品相关蛋白总含量最低为0.9%，最高为58.2%，不同企业产品的制品相关蛋白含量存在较大的差异。得到含量大于3.0%的相关蛋白峰的数量最高为5个，含量大于3.0%的单个相关蛋白峰的含量最高为19.9%。从结果看，本次检测A企业的产品相关蛋白含量最低（典型色谱图见图 1-B），E企业的制品相关蛋白含量最高（典型色谱图见图 1-C），7家企业的制品相关蛋白符合要求的为5家，不符合要求的为2家，同一厂家不同批次产品的结果较为相似。对于不符合要求的产品，其制品相关蛋白产生的具体原因有待各厂家予以分析调查，并可能需要改进生产工艺，以提高产品的质量。另外，需要指出的是，D、E、F和G 4家企业的产品在干扰素α-2主峰后紧随有较大的未得到有效分离的肩峰，特别是E、F和G 3家企业的产品，该峰的高度几乎与主峰接近（见图 1-C、D）。参考以往的研究^[5-6]，该峰很有可能是N端甲硫氨酸化的干扰素α-2，而在本次检测中未把该峰作为相关蛋白计算，这有待以后采用质谱分析等手段予以证明。

表 1 Table 1

表 1 EP方法测定20批重组人干扰素α-2原液相关蛋白含量的结果 Table 1 Results of related protein content from 20 batches rhIFNα-2b bulk substances analyzed by the EP method 生产厂家 （manufacturer） 批号 （batch number） 相关蛋白的总含量 （total content of related protein）/% 含量大于3%的相关蛋白峰的数量 （number of related protein peak which content is more than 3%） 各个大于3%的相关蛋白峰的含量 （content of related protein peak whose content is more than 3%） A CS2017E01 0.9 0 不适用（not applicable） CS2017E02 1.6 0 不适用（not applicable） B 20180330 2.4 0 不适用（not applicable） 20180413 3.5 0 不适用（not applicable） 20180421 3.0 0 不适用（not applicable） C 14API116002 2.3 0 不适用（not applicable） 14API116004 2.7 0 不适用（not applicable） 14API116007 2.6 0 不适用（not applicable） D Yy20180106IFN 2.1 0 不适用（not applicable） Yy20180207IFN 1.9 0 不适用（not applicable） Yy20180104IFN 2.1 0 不适用（not applicable） Yy20180105IFN 2.0 0 不适用（not applicable） Yy20180208IFN 2.2 0 不适用（not applicable） E B201802005 58.1 5 8.1，13.5，15.2，4.0，15.8 B201802006 36.6 3 3.8，8.4，19.9 B201803007 58.2 5 5.1，12.4，15.2，5.7，17.6 F 20170801 23.9 2 4.0，17.0 G GY18302 2.7 0 不适用（not applicable） GY18303 3.1 0 不适用（not applicable） GY18402 2.8 0 不适用（not applicable）

表 1 EP方法测定20批重组人干扰素α-2原液相关蛋白含量的结果 Table 1 Results of related protein content from 20 batches rhIFNα-2b bulk substances analyzed by the EP method

采用EP的标准和方法对7家企业生产的20批重组人干扰素α-2原液进行制品相关蛋白含量的分析，其中2家企业的产品不符合规定，且相关蛋白含量严重超标。从本次调查性检测的结果看，一方面部分企业产品的质量离国际药品标准的要求还有较大差距，另一方面也有多家企业的产品达到相关质量要求来满足市场需求，目前已具备提高药典标准、淘汰质量较差产品的条件。因此，为了提高干扰素产品的质量使其达到国际标准，建议在下一版《中国药典》的重组人干扰素α-2原液质量标准中，增加制品相关蛋白含量检测项目。