2018, Vol. 38 
骨刺片由昆布、骨碎补、党参、桂枝、威灵仙、牡蛎（煅）、杜仲叶、鸡血藤、附片、制川乌、制草乌、延胡索（制）、白芍、三七、马钱子粉共15味中药组成，具有散风邪、祛寒湿、舒筋活血、通络止痛的功效，临床上用于治疗颈椎等骨关节增生性疾病，对风湿、类风湿性关节炎有一定疗效[1]。本品收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第十七册，原标准项下马钱子粉的含量测定是采用薄层扫描法（TLCS法）测定士的宁的含量[2]。马钱子粉为马钱子药材粉碎成细粉，加适量淀粉混匀制得，其主要成分为士的宁和马钱子碱，它们既是有效成分也是毒性成分，其中士的宁对中枢系统的毒性较大，成人口服5~10 mg就会有中毒现象[3-4]。马钱子碱的含量仅次于士的宁，可阻断神经肌肉传导，呈现箭毒性[5]。
马钱子粉收载于《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2015年版一部，其中含量测定项为高效液相色谱（HPLC）方法测定士的宁和马钱子碱的含量[6]51。骨刺片现行标准采用TLCS方法仅测定士的宁的含量，方法误差较大，且缺乏对马钱子碱的含量控制。本文拟建立骨刺片中士的宁和马钱子碱的HPLC含量测定方法。目前对照提取物和混合对照溶液作为单体对照品的替代已得到广泛应用[7-9]。鉴于士的宁和马钱子碱单体对照品毒性较大，本文拟采用马钱子生物碱对照提取物（简称对照提取物）和马钱子生物碱混合对照溶液（简称混合对照溶液）替代单体对照品，测定骨刺片中士的宁和马钱子碱的含量。
本文采用建立的HPLC方法，测定了来源于10个厂家22批次的骨刺片样品。采用士的宁和马钱子碱单体对照品、对照提取物和混合对照溶液为对照，测定士的宁和马钱子碱的含量，探讨对照提取物和混合对照溶液替代单体对照品测定骨刺片中士的宁和马钱子碱含量的可行性。
1 仪器与试药Waters e2695高效液相色谱仪（沃特世公司），Mettler Toledo MX5十万分之一电子天平（梅特勒公司）。士的宁对照品（批号110705-201307）、马钱子碱对照品（批号110706-201306）、马钱子生物碱对照提取物（每支50 mg，批号112030-201601）和马钱子生物碱混合对照溶液（每支1.5 mL，批号112020-201601）均由中国食品药品检定研究院提供；实验用水为Mini Q纯水系统制备；乙腈、庚烷磺酸钠为色谱纯，其他试剂均为分析纯。骨刺片均为市售，10个厂家共22批次样品。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品溶液分别精密称取士的宁和马钱子碱的对照品适量约10 mg），置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成混合溶液，即得。
2.1.2 对照提取物溶液精密称取对照提取物（约20 mg，其中士的宁含量为49.9%，马钱子碱含量为45.4%）于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.3 混合对照溶液取混合对照溶液1支（含0.14 mg·mL-1士的宁，0.10 mg·mL-1马钱子碱），即得。
2.1.4 供试品溶液取骨刺片样品50片，去包衣，精密称定，研细，精密称取6 g，置圆底烧瓶中，加三氯甲烷20 mL，氨水1 mL，水浴加热回流1 h，放冷滤过，滤渣用三氯甲烷洗涤3次，合并滤液和洗液，置水浴蒸干，蒸干后固体加三氯甲烷溶解并定量转移置5 mL量瓶中，以三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2 色谱条件色谱柱：Waters Sunfire C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.01 mol·L-1庚烷磺酸钠与0.02 mol·L-1磷酸二氢钾等量混合溶液（用10%磷酸调节pH至2.8）（21:79）；流速1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：260 nm；进样量：10 μL。在上述条件下，3批次不同厂家骨刺片样品及对照提取物、混合对照溶液、对照品的HPLC色谱图见图 1。
|
1.马钱子碱（brucine）2.士的宁（strychnine） A、B、C.不同厂家样品（samples from different manufacturers）D.对照提取物（reference extracts）E.混合对照溶液（mixture reference solution）F.对照品（reference substances of strychnine and brucine） 图 1 HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms |
取对照品溶液、对照提取物溶液和混合对照溶液，分别进样1、2、3、4和5 μL。以进样量X（μg）为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，进行线性回归，计算回归方程。
采用对照品，士的宁及马钱子碱的回归方程分别为：
| $\begin{array}{l} Y = 2 \times {10^6}X - 365{\rm{\;}}652{\rm{\;\;\;\;}}\mathit{r = }{\rm{0}}{\rm{.999\;0}}\\ \mathit{Y = }{\rm{2 \times 1}}{{\rm{0}}^{\rm{6}}}X + 25\;740{\rm{\;\;\;\;}}\mathit{r}{\rm{ = 1}}{\rm{.000}} \end{array} $ |
采用对照提取物，士的宁及马钱子碱的回归方程分别为：
| $\begin{array}{l} Y = 2 \times {10^6}X + 118\;075{\rm{\;}}\mathit\;\;\;\;{r = }{\rm{1}}{\rm{.000}}\\ \mathit{Y = }{\rm{2}} \times {10^{\rm{6}}}X + 27\;515{\rm{\;\;\;\;\;\;}}\mathit{r = }{\rm{0}}{\rm{.9999}} \end{array} $ |
采用混合对照溶液，士的宁及马钱子碱的回归方程分别为：
| $\begin{array}{l} \mathit{Y = }{\rm{2}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{6}}}X + 118\;069{\rm{\;\;\;\;}}\mathit{r = }{\rm{0}}{\rm{.9984}}\\ \mathit{Y = }{\rm{2}} \times {\rm{1}}{{\rm{0}}^{\rm{6}}}X + 24\;576{\rm{\;\;\;\;}}\mathit{r}{\rm{ = 1}}{\rm{.000}} \end{array} $ |
结果表明，士的宁进样量在0.14~10.00 μg，马钱子碱进样量在0.10~10.00 μg范围内与峰面积线性关系良好。
2.4 精密度试验吸取同一供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，结果士的宁和马钱子碱峰面积的RSD（n=6）分别为0.50%和1.2%。
2.5 稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按上述色谱条件进样测定，结果士的宁和马钱子碱峰面积的RSD（n=6）分别为1.4%和1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.6 重复性试验取同一骨刺片样品，平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别测定士的宁和马钱子碱的含量，结果平均含量分别为0.55和0.15 mg·g-1，RSD均为1.5%，表明重复性可满足分析要求。
2.7 回收率试验称取已知含量的骨刺片粉末3 g共18份，精密称定，再分别精密加入“2.1.1、2.1.2和2.1.3”项下溶液各5 mL，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，以对照品、对照提取物和混合对照溶液计算，士的宁的平均回收率（n=6）分别为95.7%、98.8%、97.5%，RSD分别为1.6%、1.2%和1.4%；马钱子碱的平均回收率（n=6）分别为97.7%、99.5%和96.9%，RSD分别为1.3%、0.92%和2.0%，见表 1所示。
|
表 1 对照品、对照提取物和混合对照溶液回收率结果 Table 1 Results of the recovery rates of reference substance, reference extracts and mixture reference solution |
取骨刺片样品22批次，分别按“2.1.4”项下方法平行制备2份供试品溶液，依据上述HPLC色谱条件进行样品测定，采用外标法计算骨刺片中士的宁和马钱子碱的含量，结果见表 2。
|
|
表 2 骨刺片中士的宁和马钱子碱含量测定结果 Table 2 Content of strychnine and brucine in Guci tablets |
本文参考了《中国药典》2015年版一部马钱子项下方法[6]50及文献[10-11]方法，建立了骨刺片中士的宁和马钱子碱的HPLC含量测定方法，并对10个厂家22批次骨刺片样品进行测定。本文同时采用骨刺片现行标准方法TLCS测定上述样品中士的宁含量，结果在0.09~0.52 mg·g-1之间，与HPLC方法测得的士的宁含量结果（0.09~0.69 mg·g-1之间）较为一致。但由于HPLC方法灵敏度高，建议将骨刺片中士的宁含量测定方法修订为HPLC方法。
其次，本文采用士的宁、马钱子碱对照品，与混合对照溶液和对照提取物对骨刺片中士的宁和马钱子碱含量进行比较。结果表明，采用对照品溶液、对照提取物和混合对照溶液检测，以One-Way ANOVA对测定结果进行统计，骨刺片中士的宁和马钱子碱含量无显著性差异（P < 0.05）。鉴于士的宁和马钱子碱为剧毒化学品，发放和使用具有严格的限制[12]，而混合对照溶液和对照提取物中士的宁和马钱子碱含量较低，且对照提取物价格也更为低廉，更易获得[13-14]，因此对照提取物和混合对照溶液可替代单体对照品测定骨刺片中士的宁和马钱子碱的含量，为今后毒性对照品发放和替代提供数据支持。
| [1] |
中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂.第十七册[S].1998: 202 Drug Specifications Promulgated by the Ministry of Public Health, P. R. China.Chinese Patent Medicine.Vol 17[S].1998: 202 |
| [2] |
曹玲, 冯有龙, 王亚超, 等. 骨刺片的质量标准研究[J]. 中国药品标准, 2011, 12(3): 191. CAO L, FENG YL, WANG YC, et al. Study on quality control of Guci tablets[J]. Drug Stand China, 2011, 12(3): 191. DOI:10.3969/j.issn.1009-3656.2011.03.012 |
| [3] |
王伟. 马钱子的炮制质量研究[J]. 内蒙古中医药, 2017, 36(3): 98. WANG W. Preparation research of Strychnos nux-vomica L[J]. Nei Mongol J Tradit Chin Med, 2017, 36(3): 98. DOI:10.3969/j.issn.1006-0979.2017.03.089 |
| [4] |
邹龙, 桂卉, 黄世超, 等. 不同粒径马钱子粉体中士的宁在大鼠体内的药代动力学研究[J]. 中华中医药杂志, 2009, 24(12): 1568. ZOU L, GUI H, HUANG SC, et al. Study on pharmacokinetics of brucine from normal and ultra-micro powder of Semen Strychni in rats[J]. China J Tradit Chin Med Pharm, 2009, 24(12): 1568. |
| [5] |
黄喜茹, 曹冬. 马钱子研究进展[J]. 上海中医药杂志, 2005, 39(1): 62. HUANG XR, CAO D. Research advancement of Strychni Semen[J]. Shanghai J Tradit Chin Med, 2005, 39(1): 62. DOI:10.3969/j.issn.1007-1334.2005.01.027 |
| [6] |
中华人民共和国药典2015年版.一部[S].2015: 50, 51 ChP 2015.VolⅠ[S].2015: 51 |
| [7] |
陈沛, 金红宇, 孙磊, 等. 对照提取物在中药整体质量控制中的应用[J]. 药物分析杂志, 2016, 36(2): 185. CHEN P, JIN HY, SUN L, et al. Application of extractive reference substance in holistic quality control of traditional Chinese medicine[J]. Chin J Pharm Anal, 2016, 36(2): 185. |
| [8] |
何风艳, 戴忠, 何轶, 等. 西红花苷对照提取物的研究及其在西红花饮片质量控制中的应用[J]. 中国中药杂志, 2015, 40(12): 2378. HE FY, DAI Z, HE Y, et al. Study on crocins regerence extract and application on assay of Croci Stigma[J]. China J Chin Mater Med, 2015, 40(12): 2378. |
| [9] |
孙琳琳, 王海亮, 张静, 等. 津力糖平片对照品溶液稳定性的研究[J]. 中国医院用药评价与分析, 2014(10): 873. SUN LL, WANG HL, ZHANG J, et al. Stability of the reference solution of Jinlitangping tablets[J]. Eval Anal Drug Use Hosp China, 2014(10): 873. |
| [10] |
周娟娟.马钱子粉质量标准及马钱子指纹图谱研究[D].南京: 南京中医药大学, 2009 ZHOU JJ.Study on Semen Strychni and Fingerprint Chromatograms[D].Nanjing: Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, 2009 |
| [11] |
袁晓芳, 张舒. 骨刺片制剂的HPLC指纹图谱[J]. 中国医院药学杂志, 2015, 35(4): 314. YUAN XF, ZHANG S. Research on HPLC fingerprint of Guci tablets[J]. Chin J Hosp Pharm, 2015, 35(4): 314. |
| [12] |
邢跃文. 马钱子炮制与毒性关系的研究[J]. 中国民间疗法, 2005, 13(2): 57. XING YW. Study on concoct and toxicity in Strychni Semen[J]. China Naturopathy, 2005, 13(2): 57. DOI:10.3969/j.issn.1007-5798.2005.02.074 |
| [13] |
王菲菲, 吴寿海, 王明娟, 等. 马钱子生物碱混合对照溶液稳定性研究[J]. 广州中医药大学学报, 2018, 35(2): 328. WANG FF, WU SH, WANG MJ, et al. Study on stability of mixture reference solution of Strychni alkaloids[J]. J Guangzhou Univ Tradit Chin Med, 2018, 35(2): 328. |
| [14] |
王菲菲, 吴寿海, 张聿梅, 等. 马钱子对照提取物的研究及其在马钱子药材及复方制剂质量控制中的应用[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(7): 1228. WANG FF, WU SH, ZHANG YM, et al. Study on reference extracts of Strychni Semen and application on assay of crude drug and compound preparation[J]. Chin J Pharm Anal, 2018, 38(7): 1228. |