2018, Vol. 38 
骨刺片收载于《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第17册，由马钱子粉、制川乌、制草乌、附片等15味药材组成，具有散风邪，祛寒湿，舒筋活血，通络止痛的功效，临床用于骨关节增生性疾病和风湿、类风湿性关节炎的治疗[1]。处方中附片、制川乌和制草乌均含有毒性极强的二萜双酯型生物碱，包括乌头碱、次乌头碱和新乌头碱以及毒性较弱的单酯型生物碱，包括苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和苯甲酰新乌头原碱[2]。3味药材中的毒性成分也是发挥镇痛作用的有效成分[3]。骨刺片现行卫生部药品标准（WS3-B-3290-98）较为简单，仅对马钱子粉以薄层色谱法进行鉴别和含量测定，对附片、制川乌、制草乌3味毒性药味均无质控项目。
毒性药味对于制剂的有效性和安全性具有较大影响，是相关中成药质量控制和评价的一项重点内容。目前，中成药乌头碱类成分的检测主要使用高效液相色谱法[4]或高效液相色谱-质谱联用法[5-8]。其中，HPLC-MS/MS法具有专属性强，灵敏度高，重复性好的优势，已广泛应用于中药材[9-10]、复方制剂[11]的定量分析以及中药的代谢研究[12]。本研究采用HPLC-MS/MS技术同时测定骨刺片中苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱以及延胡索（制）中镇痛活性成分延胡索乙素的含量，为评价和控制骨刺片的质量提供科学依据。
1 仪器与试药Agilent 1260-6410B液相色谱-质谱联用系统，安捷伦Mass Hunter化学工作站；Mettler XS105DU电子天平；KQ-300DA型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，超声功率300 W，频率40 kHz）；甲酸、甲醇为色谱纯，盐酸分析纯，水为Milli-Q系统制备。
延胡索乙素（批号110726-201718）、苯甲酰新乌头原碱（批号111795-201604）、苯甲酰乌头原碱（批号111794-201303）、苯甲酰次乌头原碱（批号111796-201303）、新乌头碱（批号110799-201608）、次乌头碱（批号110798-201609）、乌头碱（批号110720-201312）的对照品均由中国食品药品检定研究院提供；骨刺片共18批（规格为每片重0.34 g），均为市售样品。
2 方法与结果 2.1 测定条件 2.1.1 色谱条件采用Agilent Zorbax Eclipse Plus（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸甲醇为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0~10 min，30%A；10~14 min，30%A→70%A；14~16 min，70%A→90%A；16~18 min，90%A；18~19 min，90%A→30%A；19~29 min，30%A），流速0.3 mL·min-1，进样量1 μL。
2.1.2 质谱条件采用电喷雾离子源（electronic spray ionization，ESI），正离子扫描，多反应监测模式（multiple reaction monitoring），干燥气温度350 ℃，干燥气流速10 L·min-1，雾化气压力2.07×105 Pa，源电压4 kV，各化合物裂解电压及碰撞能量等质谱参数见表 1，MRM图谱见图 1。
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1.延胡索乙素（tetrahydropalmatine）2.苯甲酰乌头原碱（benzoylaconine）3.苯甲酰新乌头原碱（benzoylmesaconine）4.苯甲酰次乌头原碱（benzoylhypaconine）5.乌头碱（aconitine）6.新乌头碱（mesaconitine）7.次乌头碱（hypaconitine） 图 1 对照品（A）和骨刺片样品（B）的HPLC-MS/MS色谱图 Figure 1 HPLC-MS/MS chromatograms of reference substances(A)and Guci tablet sample(B) |
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表 1 各成分色谱及质谱测定参数 Table 1 The chromatographic and mass spectral parameters of analytes |
精密称取延胡索乙素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的对照品适量，加0.01%盐酸甲醇溶液制成每1 mL含上述7个化合物分别为0.4、0.4、0.6、0.4、0.2、0.2、0.2 mg的对照品储备液，即得。
2.3 供试品溶液制备取样品10片，除去包衣，研细，取约0.68 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.01%盐酸甲醇溶液50 mL，密塞，称量，冰浴下超声处理（功率300 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再称量，用0.01%盐酸甲醇溶液补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液5 mL于25 mL量瓶中，用0.01%盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 方法学研究 2.4.1 线性关系考察取各对照品储备液，分别精密量取延胡索乙素储备液1 mL，苯甲酰新乌头原碱储备液1 mL，苯甲酰乌头原碱储备液1 mL，苯甲酰次乌头原碱储备液1 mL，新乌头碱储备液3 mL，次乌头碱储备液3 mL，乌头碱储备液3 mL，置于同一25 mL量瓶中，以0.01%盐酸甲醇溶液定容，得到每1 mL含上述7个化合物分别为17.98、16.89、22.68、17.17、26.12、24.72、26.21 μg的混合对照品溶液，并逐级稀释，得到系列混合对照品溶液，分别进样1 μL，记录峰面积。以待测成分质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线并进行线性回归。7个成分的线性范围、回归方程、相关系数分别见表 2。
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表 2 7个成分的线性范围、回归方程、检测下限和定量下限 Table 2 Linear ranges, regression equation, LOD and LOQ of 7 components |
将混合对照品溶液稀释至不同浓度，进样测定，以信噪比3:1为检测下限和10:1为定量下限，分别测定检测下限和定量下限。结果见表 2。
2.4.3 精密度试验取延胡索乙素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱质量浓度分别为0.07、0.07、0.09、0.06、010、0.10、0.10 μg·mL-1的混合对照品溶液连续进样5次，结果上述7个成分峰面积的RSD分别为1.5%、0.66%、1.2%、1.7%、2.4%、0.68%、2.1%，表明精密度良好。
2.4.4 重复性试验分别精密称取同一骨刺片样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算得延胡索乙素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的平均含量分别为45.58、222.51、55.84、82.36、1.31、26.83、1.60 μg·g-1，RSD分别为2.4%、1.4%、1.7%、2.3%、2.1%、1.8%、1.6%，表明方法重复性良好。
2.4.5 稳定性试验取“2.4.4”项下同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h进样测定峰面积，结果延胡索乙素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰面积的RSD分别为0.89%、1.1%、1.3%、1.7%、3.4%、2.0%、2.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4.6 回收率试验精密称取“2.4.4”项已测知7个成分含量的骨刺片样品0.34 g共6份，分别精密加入延胡索乙素、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱质量浓度分别为0.296 6、1.689、0.385 6、0.549 6、9.707×10-3、0.220 0、1.000×10-2 μg·mL-1的混合对照品溶液50 mL，按“2.3”项下方法制备供试溶液，进样测定，结果见表 3。
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表 3 回收率试验结果 Table 3 The results of recovery test |
取18批骨刺片样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下条件进样测定，以标准曲线法计算含量，结果见表 4。
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表 4 骨刺片中7个成分的含量测定结果(n=2) Table 4 Content determination results of 7 components in Guci tablets |
骨刺片处方中含15味药材，附子、制川乌、制草乌及延胡索（制）在处方中所占比例有限，且目标成分含量较低，采用HPLC-UV法进行检测时色谱峰干扰较多，方法灵敏度低，不能满足定量分析的需求。HPLC-MS/MS法专属性强，灵敏度高，故选择此方法进行测定。
3.2 提取溶剂的选择试验考察了氨试液+异丙醇-乙酸乙酯（1:1）、氨试液+异丙醇-二氯甲烷（1:1）、氨试液+异丙醇-三氯甲烷（1:1）以及0.01%盐酸甲醇溶液的提取效果。结果表明上述4种溶剂提取效率相当，但使用前3种溶剂的重复性较差，因此参考香港中药材标准[13]，采用0.01%盐酸甲醇溶液作为提取溶剂，重复性明显提高，稳定性也满足分析方法的要求。
3.3 测定结果分析18批样品中双酯型生物碱的含量（以乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的总量计）为0~10.11 μg·片-1，按照每日服用量折算后，远低于《中华人民共和国药典》2015年版附子、制川乌、制草乌项下限度[14]，安全性风险较低；18批样品中单酯型生物碱含量（以苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的总量计）和延胡索乙素含量差异较大，部分样品的含量极低，表明骨刺片3种毒性药材的投料可能存在一定问题。应考虑在骨刺片质量标准中增加这些成分的测定项目，以保证制剂的安全有效。此外，文献报道乌头生物碱溶液的稳定性与溶剂种类相关[15-16]，且乌头生物碱、延胡索乙素在温度较高时不稳定[17-18]，附片、制川乌、制草乌、延胡索（制）的浸膏生产工艺参数是否适宜，应引起厂家关注。
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