2018, Vol. 38 
2. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050;
3. 北京振东光明药物研究院有限公司, 北京 100085;
4. 北京大学前沿交叉研究院, 北京 100871
2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China;
3. Zhendong Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd., Beijing 100085, China;
4. Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, Beijing 100871, China
近年来，随着临床用药种类及数量不断增加，中药注射剂在众多药物中独树一帜，应用较为广泛[1]。从临床应用的角度来看，其与普通制剂相比，为高风险品种，中药注射液的安全问题一直受到广泛关注，其中重金属及有害元素成为中药制剂毒副作用的一大来源，所以探索中药注射剂重金属及有害元素检测方法显得尤为重要[2-8]。复方苦参注射液处方为苦参和白土苓，辅料包括聚山梨酯80、氢氧化钠、醋酸；具有清热利湿，凉血解毒，散结止痛的功效，用于治疗癌肿疼痛、出血。由于中药注射液成分复杂，对测定可能形成较强的基质干扰，如果不能直接稀释测定，需预先加以破坏、排除[9-14]。本文采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS法），将样品消解后同时测定复方苦参注射液中铜、砷、镉、汞、铅5种元素的含量。该方法操作简便，准确可靠，专属性强，可对复方苦参注射液中重金属及有害元素残留进行监控，为其他中药注射液中重金属及有害元素残留的检测提供有益的借鉴，为相关药品风险监控提供技术参数。
1 仪器与试药安捷伦7700电感耦合等离子体质谱仪，Milli-Q超纯水处理系统，CEM MARS 5微波消解仪。
试药：色谱级硝酸（Fisher Scientific公司），去离子水（Milli-Q超纯水处理系统制备）；铜（Cu）、、砷（As）、镉（Cd）、汞（Hg）、铅（Pb）单元素标准溶液购于中国计量科学研究院，其中Cu、As、Cd、Hg单元素标准溶液质量浓度为1 000 μg·m L-1，Pb单元素标准溶液质量浓度为100 μg·m L-1；调谐溶液为锂（Li）、钇（Y）、铈（Ce）、钛（Ti）、钴（Co）的混合标准溶液（Agilent公司，质量浓度为10 μg·m L-1，）；混合内标为100 μg·m L-1的锂（Li）、钪（Sc）、锗（Ge）、铑（Rh）、铟（In）、铽（Tb）、镥（Lu）、铋（Bi）的混合溶液（Agilent公司，批号5188-6525），稀释100倍使用。高纯氩气（北京诚维信科技发展公司）。
复方苦参注射液样品由山西振东制药股份有限公司提供，批号20161035、20160708、20161030、20160211、20160901、20160116、20160601、20160516、20160710、20161224，规格均为每支5 mL。
2 试验条件射频功率为1.55 kW，载气（高纯氩气）流速为1.05 L·min-1，等离子气体流速为15.0 L·min-1，蠕动泵转速0.2 r·s-1，雾化室温度为2 ℃，辅助气流量为0.8 L·min-1；He气流量为5 mL·min-1；数据采样模式：跳峰采集模式；采样深度为10 mm；重复次数为3次；扫描次数为100次。选取同位素为63Cu、75As、114Cd、202Hg和208Pb，其中63Cu、75As以72Ge作为内标，114Cd以115In作为内标，202Hg、208Pb以209Bi作为内标。
3 溶液制备 3.1 混合标准储备溶液（临用现配）精密量取As单元素标准溶液1 mL置10 mL量瓶中，用5%硝酸溶液定容至刻度，配成As标准储备溶液；另精密量取Cd单元素标准溶液1 mL及Hg单元素标准溶液1 mL置同一100 mL量瓶中，用5%硝酸溶液定容至刻度，配成Cd、Hg混合标准储备溶液。分别取Cd、Hg混合储备溶液1 mL，砷标准储备溶液1 mL，Pd单元素标准溶液2 mL，Cu单元素标准溶液1 mL，置同一100 mL量瓶中，用5%硝酸溶液定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含Cu 10 μg，Pb 2 μg，As 1 μg，Cd 0.1 μg，Hg 0.1 μg的混合标准储备溶液。
3.2 系列混合标准溶液（临用现配）精密量取混合标准储备溶液10.0、5.0、2.0、1.0 mL，分别置100 mL量瓶中，加5%硝酸溶液稀释至刻度，得标准曲线第7点、第6点、第5点和第4点的混合标准溶液；再精密量取标准曲线第7点混合标准溶液5.0、2.0、1.0 mL，分别置100 mL量瓶中，加5%硝酸溶液稀释至刻度，得标准曲线第3点、第2点、第1点的混合标准溶液。
3.3 混合内标溶液精密量取含72Ge、115In、209Bi的混合内标适量，用5%硝酸溶液稀释制成质量浓度均为1 μg·m L-1的溶液，即得（0~5 ℃密封贮存）。
3.4 样品前处理及供试品溶液制备精密量取待测样品3 mL，分别置消解罐中，加硝酸8.0 mL，置加热板120 ℃加热2 h，取出消解罐，放冷，将消解液转入50 mL量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并至量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。同法制备试剂空白溶液。
4 测定方法取供试品溶液进样测定，定量分析采用标准曲线法结合内标校正，按试验条件，分别对系列混合标准溶液、试剂空白溶液及供试品溶液进行分析测定。
5 方法学考察 5.1 线性范围与灵敏度取“3.2”项下系列混合标准溶液，进样测定，仪器的内标进样管在仪器分析工作过程中始终插入混合内标溶液中，依次将样品管插入各个浓度的混合标准溶液中进行测定，以各元素与内标测量值的比值Y为纵坐标，相应质量浓度X（ng·m L-1）为横坐标，分别绘制随行标准曲线；结果表明，各元素的线性关系良好（r > 0.999 8）。另外按照样品前处理方法，制备15份试剂空白溶液，依法测定，计算15份结果的SD，以其3倍SD除以斜率作为检测下限，10倍SD除以斜率作为定量下限，结果见表 1。
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表 1 线性范围、检测下限及定量下限 Table 1 Linear range, LOD and LOQ |
取标准曲线第6点的混合标准溶液连续进样6次，计算强度（cps）的RSD；结果Cu、As、Cd、Hg、Pb的RSD分别为1.2%、1.3%、0.78%、1.5%、1.0%，表明精密度良好。
5.3 加样回收率及重复性精密量取待测样品（批号20161035）3 mL共18份，分别置消解罐中，每6份为1组，分别精密加入将混合标准储备溶液稀释10倍的溶液1 mL及混合标准储备溶液0.5、1 mL，加硝酸8.0 mL，按照样品前处理方法操作，制得低、中、高3个浓度水平的供试溶液各6份，进样测定，计算回收率及其RSD。由于样品中部分元素含量很低，故方法重复性以回收率的RSD表示，结果（表 2）表明方法准确性和重复性良好。
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表 2 加样回收率及重复性（n=6） Table 2 Recovery and repeatability |
精密量取待测样品（批号20161035）3 mL，置消解罐中，精密加入混合标准储备溶液1 mL及硝酸8.0 mL，按照样品前处理方法操作，制备供试品溶液，在冷藏（4 ℃）条件下保存，分别于1、2、5、10、24、48 h进样测定，计算强度（cps）的RSD；结果Cu、As、Cd、Hg、Pb的RSD分别为4.8%、5.3%、5.5%、4.6%、4.1%，表明供试品溶液稳定性良好。
6 样品测定结果取10批次样品，分别按“3.4”项下方法操作，制备供试品溶液，进样测定，结果见表 3（Hg检测下限为5.43 pg·m L-1，Cu检测下限为24.04 pg·m L-1）。根据《中华人民共和国药典》2015年版制剂通则“注射剂”项下相关规定，按各品种项下每日最大使用量计算，Pb不得超过12 μg，Cd不得超过3 μg，As不得超过6 μg，Hg不得超过2 μg，Cu不得超过150 μg；复方苦参注射液每日最大用量为20 mL，故限度为Pb不得过0.6 μg·m L-1，Cd不得超过0.15 μg·m L-1，As不得超过0.3 μg·m L-1，Hg不得超过0.1 μg·m L-1，Cu不得超过7.5 μg·m L-1；测定结果表明，10批样品均符合规定。
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表 3 样品测定结果 Table 3 Determination results |
首先考虑样品基质的干扰情况，对样品稀释后直接进样，通过回收率反映是否有基质干扰。如无基质干扰，则可以将样品稀释后直接进样，简化操作，节省人力物力；如有基质干扰，则应设计合理的样品消解条件，对样品消解后再进样分析。精密量取待测样品（批号20161035）1、2、3 mL，分别置50 mL量瓶中，精密加入混合标准储备溶液1 mL，用5%硝酸定容，通过回收率反映是否有基质干扰。从回收率结果来看（表 4），随着取样量增加，As和Hg回收率增高，在取样为2 mL以下时，基质干扰明显减弱，回收趋于正常水平。结果说明取样量较大时，基质干扰较为明显，而Cu、Cd、Pb回收率在正常范围内，几乎不受基质干扰。但是在相同的稀释倍数下，取样较少时，其样品限度落在标曲线性范围以外，检测灵敏度难以满足风险评估要求，所以需要进一步考察消解条件。
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表 4 基质干扰情况 Table 4 Matrix interference |
条件1：精密量取待测样品（批号20161035）3 mL，分别置消解罐中，加硝酸8.0 mL，置加热板120 ℃加热2 h，取出消解罐，放冷，将消解液转入50 mL量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并至量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液。同时制备空白溶液。
条件2：精密量取待测样品（批号20161035）3 mL，分别置微波消解罐中，加硝酸8.0 mL，按消解仪操作规程安装好装置，消解（3 min升温至120 ℃保持3 min，2 min升温至150 ℃保持3 min，2 min升温至190 ℃保持10 min），消解结束后，冷却至60 ℃以下，取出消解罐，放冷，将消解液转入50 mL量瓶中，用少量水洗涤消解罐3次，洗液合并至量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，制得供试品溶液。同时制备空白溶液。
取上述按2种条件制备供试品溶液，分别进样测定；实验结果显示，消解条件下，As和Hg的回收率均在正常水平范围内，明显排除了基质干扰，其他元素回收率在正常水平内；对比2种消解条件，其结果（表 5）差异并不大，而条件1为直接加热，操作简单，条件2为微波消解，消解后进行赶酸，操作相对复杂，综合考虑，选择条件1为样品前处理条件。另外，结合相关文献[15-16]，并经长期大量的实验发现，Hg元素在加热温度不超过130 ℃情况下，回收率基本保持稳定，超过130 ℃汞元素会挥发，影响测定结果准确性。
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表 5 条件对比结果（%） Table 5 Comparison results of different conditions |
精密量取待测样品（批号20161035）3 mL，分别置消解罐中，加硝酸8.0 mL，置加热板120 ℃加热，分别加热1、2、3、4、5 h，其余按“3.4”项下自“取出消解罐”起操作，制备供试品溶液，进样测定。表 6结果显示，加热1 h以上均可，考虑到样品基质复杂，排除不确定因素干扰，所以选择加热2 h，使其充分消化，确保彻底去除基质干扰。
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表 6 加热时间优化 Table 6 Heating time optimization |
由于Hg具有极强的吸附性，在检测过程中容易吸附在样品瓶、泵管及矩管上而产生记忆效应。Hg可以溶解多种金属，与之形成汞齐，其溶解度越大，形成的汞齐越稳定，越不易吸附在容器或管线表面，但溶解度过大，形成的汞齐在等离子体中难以分解离子化，金（Au）在Hg中具有一定的溶解度，能够形成金汞齐。本实验分别考察了在混合标准溶液和供试品溶液里以金-汞比2:1的量加入Au，并与不加Au的相关溶液做对比（平行6份），结果如图 1所示，无论是混合标准溶液还是供试品溶液，加Au和不加Au区别不大，考虑到实验成本，故选择不加Au元素溶液。同时，考虑到测定过程中的稳定性，本试验考察了Hg标准溶液在5 h内测定结果的变化差异，其RSD在残留分析要求的范围内，结合其他未知因素，在不加稳定剂的情况下，一般应在5 h内完成测定。
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图 1 加Au与不加Au的试验结果 Figure 1 Determination results with Au and without Au |
测定时选取的同位素为63Cu、75As、114Cd、202Hg和208Pb，按照内标同位素质量数与待测元素质量数相近的原则，63Cu、75As以72Ge作为内标，114Cd以115In作为内标，202Hg、208Pb以209BI作为内标，并根据仪器的要求选用适宜校正方程对测定的元素进行校正。
7.3 小结本文通过采用ICP-MS法，同时对复方苦参注射液中重金属及有害元素的含量进行测定，方法可操作性强，为其他中药注射液中重金属及有害元素的残留检测提供了有益的探索借鉴。
中药注射液为相对短时间使用的治疗药物，区别于所有人群每日必须摄入的食品、农产品等，由于Pb、Cd、As、Hg均为公认的毒性元素，而且世界各国对其进行严格控制，在针对中药注射液限量标准制定时，需站在风险评估的角度制定合理的残留限度，建议遵循世界卫生组织（WHO）和世界粮农组织（FAO）制定的毒理学研究规范，采用其发布的权威毒理学数据，结合部分毒理学实验验证，分析中药注射剂使用特点，制定中药注射剂中重金属及有害元素最大残留限量标准；另外，中药注射液理论上均可以不经消解，有机破坏处理，直接或适当稀释后进样，但鉴于待测元素在注射液中可能会以不同的形态、价态等复杂形式存在，同时样品中的复杂基质对测定也可能产生无法预计的影响，因此，建立注射液中重金属及有害元素限量检查方法时，有必要制定相应的实验方案进行前处理条件考察。本文采用ICP-MS法，对复方苦参注射液中Cu、As、Cd、Hg、Pb重金属及有害元素检测方法进行了研究，通过对比直接进样与消解后进样，确定了样品前处理条件，优化了消解时间，并对样品进行测定。该方法操作简便，准确可靠，专属性强，可用作中药注射液重金属及有害元素残留测定。从样品分析结果看，10批复方苦参注射液中5种重金属及有害元素的含量较低，测定结果均符合规定。
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