2. 中国食品药品检定研究院, 药物非临床安全评价研究北京市重点实验室, 北京 100176;
3. 百奥泰生物科技(广州)有限公司, 广州 510530
2. National Institutes for Food and Drug Control, Key Laboratory of Beijing for Nonclinical Safty Evaluation Research of Drugs, Beijing 100176, China;
3. Bio-Thera Solutions, Co., Ltd., Guangzhou 510530, China
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性、进行性发展的可致关节损坏的自身免疫性疾病。有研究表明类风湿性关节炎与炎症细胞浸润和滑膜血管增生有关,其中炎症细胞释放的白介素-6(IL-6)可导致滑膜细胞和关节周围结构的破坏[1]。在关节炎患者中,中性粒细胞分泌蛋白水解酶并产生活性自由基,造成关节损坏,而IL-6与其膜进行受体结合从而使其发挥作用。托珠单抗(tocilizumab,TOC)是一种人源化抗IL-6受体单抗,2009年被欧盟以及2010年被美国FDA批准其应用于中、重度活动性RA的治疗。以IL-6以及受体为靶点治疗类风湿性关节炎,较非甾体抗炎药副作用小,治疗效果好。TOC于2012年在国内上市,其起效快,副作用小,在患者治疗中取得显著效果[2-3],并且对依那西普(entercept)等TNF-α抑制剂应答较差的患者仍有明显疗效,但是,由于价格昂贵,国内应用较少[4]。因此研发出的重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体BAT-1806注射液,未来将会提高在国内的使用和市场占有率。
根据重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体BAT-1806和TOC具有相同的作用靶点,其注射液的组成完全相同,BAT-1806和TOC应有相似的药代动力学特征。本文主要运用ELISA法研究了2个剂量的BAT-1806在食蟹猴体内的药代动力学动态过程,并与TOC的药代动力学参数进行了比较。
1 实验材料 1.1 样品样品:重组人源化抗人IL-6R单克隆抗体注射液(BAT-1806注射液,规格为每支4 mL,20 mg·m L-1,百奥泰生物科技(广州)有限公司,批号N20150701);参照药:托珠单抗(TOC)注射液,商品名ACTEMRA®,规格为每支4 mL,20 mg·m L-1,Roche Pharma(Schweiz)Ltd,批号B1016B01)
1.2 试剂Super Block Blocking Buffer(Thermo Fisher,批号为QH220717),Tween20(Sigma,批号为SZBD1000V),10XPBS(Roche,批号11880500),四甲基联苯胺显色剂(标准级,北京欣博盛生物科技有限公司,批号为14P06),浓硫酸(北京化工厂,批号为20100315),IL-6R(北京义翘神州生物科技有限公司,批号LC09AP0803),HRP标记的山羊抗人IgG-Fc抗体(北京义翘神州生物科技有限公司,批号HG08AU0602),TMB显色液(北京欣博盛生物科技有限公司),包被缓冲液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline,Sigma),封闭液(Super Block Blocking Buffer in PBS,Thermo Fisher)
1.3 主要仪器SpectraMax-384酶标仪(Molecular Devices),2005-2低温培养箱(VWR),AX205电子天平(Mettler Toledo),Stuart SA8涡旋仪(BIBBY STERILIN)
1.4 实验动物食蟹猴,普通级(实验动物合格证:No.11805300000130),24只,雌雄各半,年龄3~4岁,雌性2.45~3.00 kg,雄性2.45~2.95 kg。
2 方法 2.1 间接ELISA法 2.1.1 标准曲线样品及质控样品的配制取BAT-1806注射液和TOC注射液(质量浓度均为20 mg·m L-1)适量,用PBS配制的10%食蟹猴空白血浆分别稀释,得到质量浓度分别为75、50、25、12、8、4、2、1、0.5 ng·m L-1的标准曲线样品;另外配制质量浓度分别为50、40、10、2、1 ng·m L-1的质控(QC)样品,用于考察特异性、准确性、精密度和稀释线性等。
2.1.2 ELISA测定步骤取IL-6R包被96孔酶标板,每孔加1 μg·m L-1的IL-6R溶液100 μL,4 ℃静置过夜。取出包被好的酶标板,洗板3次拍干。然后每孔加入封闭液100 μL,37 ℃条件下孵育1 h,洗板3次拍干。分别加入标准曲线样品、各类质控样品及稀释后的待测样品,每种样品均设2个复孔,37 ℃条件下孵育1 h,洗板3次拍干。加入HRP标记的山羊抗人IgG-Fc抗体100 μL,37 ℃条件下孵育1 h,洗板3次拍干,每孔加入TMB显色液100 μL,37 ℃条件下避光显色10 min,每孔加入浓硫酸100 μL,终止反应,在450 nm/650 nm波长处读取各孔的吸收度。
2.1.3 数据处理将标准曲线样品浓度值(x)与所测定的吸收度(y)利用SoftMax Pro v5软件的四参数法进行拟合,根据得到的四参数方程式计算待测样品的浓度。四参数方程如下:
$ y = \frac{{A - D}}{{1 + {{\left( {\frac{x}{C}} \right)}^B}}} + D $ |
其中,y是吸收度,x是浓度(ng·m L-1);A、B、C、D为方程的4个参数,A是曲线上渐近线估值,D是曲线下渐近线估值,B是曲线的斜率,C是最大结合一半时对应的浓度值。
2.2 药代动力学试验 2.2.1 给药方案24只食蟹猴根据体质量按分层随机化分组法分为4组,每组6只(雌雄各半),参考TOC临床前研究和临床应用相关信息,预计BAT-1806的临床拟用剂量为4 mg·kg-1或8 mg·kg-1,本研究设定给药低、高剂量分别为10和30 mg·kg-1,按体质量kg折算,分别为临床拟用高剂量的1.25和3.75倍。给药方案参见表 1。
给药前及给药后0、0.5、1、2、5、10、24、48、96 h,7、10、14、19、24、29、35、42、49、56 d从食蟹猴四肢静脉采血,每只动物每个时间点采血约0.8 mL,置于预先EDTA-2Na抗凝的离心管中,4 ℃下8 000 r·min-1离心10 min,分离血浆,于-70 ℃冰箱中冻存备用。根据预实验测定的结果,将样品取出融化,用10%食蟹猴空白血浆进行适当倍数稀释,然后加样用“2.1.2和2.1.3”项的方法测定并计算BAT-1806和TOC的浓度。
2.2.3 数据处理用WinNonlin(V2.1A)软件,按非房室统计矩模型计算静脉给药后每只食蟹猴的主要药代动力学参数;采用Microsoft EXCEL(2010)计算均值、标准差(SD)、相对标准偏差(RSD)、Cmax与AUC的比例参数以及进行剂量-暴露量线性关系的分析;使用GraphPad Prism 6进行各类数据统计学处理。
3 结果 3.1 食蟹猴血浆中BAT-1806的ELISA分析方法建立与确证 3.1.1 标准曲线测定质量浓度为75、50、25、12、8、4、2、1、0.5 ng·m L-1的9个标准曲线样品,每个标准曲线样品复孔,按“2.1.2”和“2.1.3”项方法操作,共考察7条标准曲线,BAT-1806及TOC的标准曲线定量范围均为1~50 ng·m L-1(R2 > 0.998),BAT-1806标准曲线上各点的准确度为83.6%~111.9%,TOC标准曲线上各点的准确度为81.4%~111.0%,说明标准曲线的稳定和重现性良好。
3.1.2 方法特异性空白食蟹猴血浆中添加LQC(2 ng·m L-1)的样品和质量浓度分别为1、2、10 ng·m L-1的阿达木(ADA),添加HQC(40 ng·m L-1)的样品和质量浓度分别为10、40、50 ng·m L-1的阿达木(ADA),按“2.1.2”和“2.1.3”项方法操作,BAT-1806和TOC的LQC样品回收率分别为97.8%~103.3%和93.6%~117.2%,HQC样品回收率分别为90.6%~104.8%和97.9%~107.3%,未加入分析物的空白食蟹猴血浆吸收度均值分别为0.087和0.055,分别低于定量下限吸收度均值0.184和0.143,该方法特异性良好。
3.1.3 回收率与精密度质控(QC)样品每次测定5个浓度(50、40、10、2、1 ng·m L-1),每个浓度复孔加样,日内回收率与精密度测定3次,日间回收率与精密度在不同日期测定7次,按“2.1.2”和“2.1.3”项方法操作,计算回收率和RSD,BAT-1806和TOC 5个QC样品日内回收率分别为82.9%~103.6%和81.0%~104.5%,RSD分别为4.6%~14.5%和1.1%~6.2%;BAT-1806和TOC的5个QC样品日间回收率分别为92.9%~104.1%和94.5%~104.2%,RSD分别为8.6%~11.6%和7.4%~12.7%。日内日间回收率精密度良好。结果见表 2。
浓度高于ULOQ(50 ng·m L-1)的BAT-1806样品和TOC样品,分别通过2倍、10倍、100倍、1 000倍、10 000倍和100 000倍稀释到标准曲线定量范围内,按“2.1.2”和“2.1.3”项方法操作,平均浓度回收率分别为99.8%~109.2%和84.0%~97.9%,RSD分别为1.6%~6.3%和1.6%~13.2%。该方法稀释线性良好。
3.2 单次静脉注射BAT-1806在食蟹猴体内的药代动力学研究 3.2.1 血浆浓度-时间曲线单次静脉给予10、30 mg·kg-1的BAT-1806注射液和TOC注射液后,按“2.2.2”和“2.2.3”项方法操作,食蟹猴平均血浆浓度-时间曲线如图 1,可以从图中看出BAT-1806与等剂量的TOC的血浆浓度-时间曲线特征是一致的。
各组食蟹猴的药代动力学参数以及参数的比较见表 3,食蟹猴单次静脉注射10 mg·kg-1和30 mg·kg-1的BAT-1806,T1/2分别为(81.6±54.5)h和(105.7±30.2)h,Cmax分别为(202 415±39 064)ng·m L-1和(613 161±133 207)ng·m L-1(2个浓度的Cmax比值为1:3.03),AUC(0-t)分别为(17 614 098±3 716 972)h·ng·m L-1和(55 333 524±16 351 767)h·ng·m L-1(2个浓度的AUC(0-t)比值为1:3.14),Vd分别为(66.6±37.5)mL·kg-1和(84.3±21.8)mL·kg-1,Cl分别为(0.58±0.13)mL·h-1·kg-1和(0.58±0.16)mL·h-1·kg-1,MRT分别为(107.8±15.5)h和(177.2±28.6)h。雌、雄食蟹猴的主要药代动力学参数经独立样本t检验无显著性差异。相同给药剂量下,BAT-1806和TOC的主要药代动力学参数经独立样本t检验无显著性差异。BAT-1806在10、30 mg·kg-1剂量范围内基本呈线性动力学特征。
在10 mg·kg-1剂量下,BAT-1806与TOC的Cmax和AUC(0-t)比率分别为0.98和1.05;在30 mg·kg-1剂量下,BAT-1806和TOC的Cmax和AUC(0-t)比率分别为0.98和0.92。BAT-1806和TOC低、高剂量的Cmax和AUC(0-t)药代动力学参数比较参见表 4,表明BAT-1806和托珠单抗生物等效。
本试验建立了食蟹猴血浆中BAT-1806及TOC的ELISA分析方法,方法的线性范围为1~50ng·m L-1(R2 > 0.998),特异性、准确度、精密度、稀释线性均符合生物样品分析的要求,适用于BAT-1806和TOC在食蟹猴体内的药代动力学研究。食蟹猴单次静脉注射BAT-1806在10、30 mg·kg-1的剂量范围内,体内消除速度较慢,平均滞留时间大于100 h,且随剂量增高延长,表观分布容积低于实际体液体积,其药代动力学特征不存在性别差异,BAT-1806和TOC在食蟹猴体内的药代动力学特征具有一致性。BAT-1806和TOC的Cmax和AUC(0-t)药代动力学参数比较,表明BAT-1806和TOC生物等效。根据自身研究的结果,也结合参比制剂TOC的药物毒理学资料中药代部分的相关参数进行了比较,结合这些也证明了本文进行的食蟹猴BAT-1806的药代动力学研究所使用的方法是有效可靠的。
[1] |
王吉波, 潘琳. 类风湿关节炎病因及其发病机制[J]. 山东医药, 2002, 42(18): 69. WANG JB, PAN L. The etiology and pathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Shandong Med J, 2002, 42(18): 69. DOI:10.3969/j.issn.1002-266X.2002.18.050 |
[2] |
EMERY P, KEYSTONE E, TONY HP, et al. IL-6 receptor inhibition with tocilizumab improves treatment outcomes in patients with rheumatoid arthritis refractory to anti-tumour necrosis factor biologicals:results from a 24-week multicentre randomised placebo-controlled trial[J]. Ann Rheum Dis, 2008, 67(11): 1516. DOI:10.1136/ard.2008.092932 |
[3] |
SCOTT DL. Biologics-based therapy for the treatment of rheumatoid arthritis[J]. Clin Pharmacol Ther, 2012, 91(1): 30. DOI:10.1038/clpt.2011.278 |
[4] |
JONES SA, SCHELLER J, ROSE-JOHN S. Therapeutic strategies for the clinical blockade of IL-6/gp130 signaling[J]. J Clin Invest, 2011, 121(9): 3375. DOI:10.1172/JCI57158 |
[5] |
ENGVALL E, PERLMANN P. Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Quantitative assay of immunoglobulin[J]. Immunochemistry, 1971, 8(9): 871. DOI:10.1016/0019-2791(71)90454-X |
[6] |
王晓秋. 酶联免疫吸附试验在蛋白质/多肽类药物药代动力学研究中的应用[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2013, 27(3): 534. WANG XQ. Application of enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)in the pharmacokinetic study of protein/peptide[J]. Chin J Pharmacol Toxicol, 2013, 27(3): 534. |
[7] |
SAMSON M, AUDIA S, JANIKASHVILI N, et al. Brief report:inhibition of interleukin-6 function corrects Th17/Treg cell imbalance in patients with rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum, 2012, 64(8): 2499. DOI:10.1002/art.34477 |
[8] |
SMOLEN JS, SCHOELS MM, NISHIMOTO N, et al. Consensus statement on blocking the effects of interleukin-6 and in particular by interleukin-6 receptor inhibition in rheumatoid arthritis and other inflammatory conditions[J]. Ann Rheum Dis, 2013, 72(4): 482. DOI:10.1136/annrheumdis-2012-202469 |
[9] |
GABAY C. Interleukin-6 and chronic inflammation[J]. Arthritis Res Ther, 2006, 8(Suppl 2): S3. DOI:10.1186/ar1917 |
[10] |
HOUSSIAU FA, DEVOGELAER JP, VAN DAMME J, et al. Interleukin-6 in synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis and other inflammatory arthritides[J]. Arthritis Rheum, 1988, 31(6): 784. DOI:10.1002/(ISSN)1529-0131 |