马科（Equidae）动物驴Equus asinus L.的皮是制作名贵中药阿胶的原材料，《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）规定阿胶为新鲜或干燥的驴皮经煎煮、浓缩制成的固体胶块^[1]。阿胶是传统补血止血中药中的翘楚，近年来价格攀升迅猛，其原料驴皮一皮难求，驴皮质量控制目前已有国家食品药品监督管理局出台的标准规范性文件作为依据，但该标准仅有性状上的描述，一些动物的皮在与动物体剥离后外观性状十分相近，难以分辨，性状鉴定的结果缺乏客观性，如牛皮、马皮，骡子的皮，骡子有马骡、驴骡之分，马骡系以马为母本与同科动物驴作为父本杂交产生的后代，驴骡系以驴为母本与马杂交产生的后代，两者均不能繁衍后代。驴皮及其混伪品加工制成胶块后，通过现有的阿胶质量标准更难以辨别。据阿胶的本草考证发现：《本草纲目》记载，在宋、元两代，阿胶曾经既有驴皮熬制的胶也有牛皮熬制的胶，随着长期的用药实践发现，驴皮胶具有良好的补血止血的功效，而牛皮胶则仅可止血，而与驴同科同属动物马的皮熬制的马皮胶则具有下血的作用，与阿胶补血作用正好相反，故后世阿胶仅保留了驴皮的原料来源，牛皮胶则称为黄明胶^[2-3]。阿胶质量急需从源头把关。

目前DNA条形码（DNA barcoding）通过对1个有效的目的基因的DNA序列进行分析，从而对物种进行鉴定已作为物种鉴定的1个有效手段^[4]，以细胞色素C氧化酶亚基1（cytochrome C oxidase subunit 1，COⅠ）为主的动物类药材物种DNA序列已被生命条码联盟（The Consortium for the Barcode of Life，CBOL）确立为动物条形码通用的序列^[5]，用于鉴定动物的基原，《中国药典》四部通则^[6]中已收载了COⅠ片段DNA扩增（PCR）的通用引物及通用的PCR反应条件。但据Hebert等^[7]对动物界11个门13 320个物种的研究结果显示，在多数动物类群中，COⅠ基因都存在显著的序列变异。在实际依据标准收载的引物及标准反应条件进行驴皮及其混伪品的条形码鉴定过程中，发现驴、马的基因序列扩增效果常常重现性不理想，致使PCR产物无法进行准确的序列测定而无法鉴定，且目前尚未见利用线粒体COⅠ基因作为马科动物驴、马、骡DNA条形码进行物种鉴定的相关研究报道。本研究对标准规定的DNA提取方法、COⅠ引物及PCR反应的条件进行优化后对牛科和马科22个样品进行了序列测定，PCR产物测序结果采用Blast与NCBI网址GenBank序列进行比对，通过邻接法构建系统树进行鉴定，结果准确。邻接法构建的系统树聚类结果显示驴、马、牛具有较好的单系性，均分别聚为独立的分支，从而使驴皮与混伪品马皮和牛皮显著区分，设计的引物针对驴、马皮的鉴定准确性高，可行性强，较好地解决阿胶原料驴皮及其混伪品^[8-10]的鉴定问题。

1 仪器及材料 1.1 仪器

MM400球磨仪（Retsch公司）；5417R型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；96孔PCR扩增仪（ABI VERITI^TM System，ABI公司）；Gene Genins凝胶成像系统，配备Image Lab^TM Software（BIO-RAD公司）；Mettler PL2002型分析天平（Mettler Toledo仪器有限公司）；DYY-7C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；Milipore A10纯水仪（Milipore公司）；高压灭菌水（ddH₂O）[采用纯水仪（18 Ω），25 ℃过滤水，高压蒸汽灭菌1 h，即得]；血液/细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（DP304）、Agarose（琼脂糖），购自天根生化科技（北京）有限公司；2×TaqPCR Mastor Mix，DNA Ladder Marker（DAN分子量标准），购自宝日医生物技术（北京）有限公司，Takara；DNA Star 7.1数据处理软件（DNAStar Inc.）；Mega（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）6.0软件（https://www.megasoftware.net）。

1.2 材料

驴皮及其混伪品总计4个物种、22份样品，由湖南省食品药品检定研究院协助收集自山东和河南两省，均为取自动物活体，鲜品冻干后于-20 ℃保存，并鉴定为驴皮4批，马皮4批，马骡皮3批，驴骡皮1批，样品现于-80 ℃冷库存放于中国食品药品检定研究院中药民族药检定所；研究选用GenBank下载的COⅠ基因序列29条，包括马科（Equidae）动物驴E.asinus、马E.caballus和牛科（Bovidae）动物黄牛Bos taurus、水牛B.indicus，序列信息见表 1。

2 方法 2.1 DNA提取

药材样品用75%乙醇浸泡清洗表面，晾干至无醇味，刮去表面，取靠下层的材料约35 mg，置2.0 mL PE管中，用灭菌剪刀剪碎，优化DNA提取试剂盒（DP304，Tiangen）说明书方法：在剪碎的材料中加入试剂盒提供细胞裂解液GA 600 μL，用研磨仪研磨2 min（30次·s^-1），使样品粉碎并呈现均匀的混悬液状态，于56 ℃水浴裂解2 h，裂解后的溶液放至室温，加入三氯甲烷500 μL，混匀，12 000 r·min^-1离心5 min，小心吸取上清液，继续依据DNA提取试剂盒说明书方法提取总DNA，作为供试品DNA模板溶液，于-20 ℃保存备用。

2.2 引物设计、PCR扩增及测序

采用DNA Star 7.1软件，通过变异位点的分析设计的引物序列，F：5’-TCT AAC CAA CCA CAA RGA YAT YGG-3’，R：5’-TAG ACT TCT GGG TGG CCR AAR AAY CA-3’，引物由华大基因公司合成，引物稀释浓度为2.5 μmol·L^-1。

2.3 PCR反应

反应体系为25 μL，体系包含ddH₂O 8.5 μL，正反向引物各1.0 μL，2×TaqPCR Master Mix12.5 μL，模板DNA 2 μL。扩增程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 5 min，5个循环；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。PCR反应设立不含DNA模板的溶液作为空白对照。

2.4 电泳检视

PCR扩增产物通过1.5%琼脂凝胶电泳、紫外光检视验证质量，取条带清晰的PCR产物，送华大基因公司，用PCR扩增引物作为测序引物进行双向测序。

2.5 序列分析

22个样品测序结果利用DNA Star 7.1软件去除引物区，用互联网上NCBI中Blast工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi）进行相似性检索比对，得到序列的物种结果，与GenBank下载基因序列，共2科5种28个COⅠ基因序列，共计50个序列用MEGA 6.0软件共同计算种内、种间遗传距离及序列碱基组成，采用邻接法构建系统树，利用Bootstrap（1 000次重复）检验各分支的支持率。

3 结果 3.1 PCR产物

琼脂糖凝胶电泳实验样品PCR产物电泳后紫外光检视，均在658 bp附近显示明亮条带，表明本研究新设计引物在4种动物中具有普遍的适用性，PCR产物可用于测序。

3.2 序列分析

采用MEGA 6.0计算全部序列的碱基组成，平均碱基组成为A 23.7%，T 28.2%，G 18.2%，C 29.9%，A+T含量（51.9%）高于G+C含量（48.1%），见表 2，序列变异位点见表 3。

3.3 种内及种间遗传距离

采用MEGA 6.0软件，基于Kimura-2-parameter（K2P）计算牛科和马科种内、种间遗传距离，结果牛科样品种内平均遗传距离为0.020，马科动物样品种内遗传距离平均值为0.012，牛科与马科样品种间平均遗传距离为0.222，两科的种间平均遗传距离约为种内平均遗传距离的11倍，远大于种内平均遗传距离。马科动物驴皮、马皮、马骡皮的种内平均K2P距离分别为0.001、0.002、0.006（驴骡皮样品仅1批，未计算种内K2P距离），驴皮与马皮、马骡皮、驴骡皮的种间平均遗传距离分别为0.122、0.123、0.063，种间距离显著大于种内距离（约10倍或以上）；马皮与马骡皮、驴骡皮的种间平均遗传距离为0.009和0.091，马皮与马骡皮的种间遗传距离接近马的种内遗传距离（0.002）。种间序列差异的显著性是对物种进行准确鉴定的先决条件^[11]，利用COⅠ基因序列有效鉴别物种的关键点是种间的遗传距离必须大于种内的遗传距离，并且距离差异大约10倍，并推荐物种鉴定最小种间遗传距离为0.020，说明COⅠ基因序列能够对牛科与马科动物进行有效的物种鉴定。超过种间最小遗传距离0.020，说明变异已达到种的分化水平；马与马骡遗传距离远小于0.020，说明二者未达到种的分化水平，见表 4。

3.4 分类及分子系统树

本研究采用邻接法，对牛科、马科49个COⅠ基因序列构建系统树，结果如图 1，可见牛科和马科样品分为两大分支，牛科下分为B.taurus和B.indicus两大分支，马下分为马E.caballus和驴E.asinus两大分支；S1~S4号驴皮样品、S5~S9号马皮样品及S14~S22号牛皮样品分别与GenBank下载的驴E.asinus、马E.caballus牛B.indicus序列各自聚类，且呈现良好的单系性，S10~S12马骡样品和S13号驴骡样品随母本分别与马和驴聚在一起。由此COⅠ序列可从基原上将马科动物驴皮与马皮、马骡皮区分，并能与牛科动物皮进行区分，但驴皮与同科的驴骡皮尚难以区分。

4 讨论与分析 4.1 药材取样注意事项

驴皮及其他样品均为冻干样品，质地硬而韧，难以用球磨机直接粉碎，且动物皮表面DNA易降解或被真菌污染，影响PCR扩增实验结果，故取样时采用剪取小部分样品，置70%乙醇中浸泡，达到清洁药材表面的目的，再刮去表面从样品内部取样，避免了真菌或其他污染物COⅠ基因的干扰。

4.2 DNA提取及PCR反应条件的优化

本研究在DNA提取步骤中，对试剂盒（GP304，Tiangen）操作说明书中的部分步骤进行了优化，以获得高质量DNA。优化后的操作步骤包括①样品在采用调整粉碎机粉碎时即加入试剂盒中GA缓冲液（GP304，Tiangen），使药材充分粉碎并混悬，有利于粉碎制成混悬液状态；②样品虽为新鲜动物皮，水浴时间设置为56 ℃水浴2 h，大大超过说明书中规定的30 min，实验表明延长裂解时间DNA溶出效果较好；③在水浴裂解后的溶液中加入三氯甲烷，起到沉淀蛋白等杂质的作用，有利于提高DNA的纯度。

4.3 《中国药典》COⅠ序列引物与自行设计引物的区别

曾采用《中国药典》四部通则9107规定的COⅠ通用引物，即正向引物5′-TAAAC TTCAG GGTGA CCAAA AAATC A-3′，反向引物5′-GGTCA ACAAA TCATA AAGAT ATTGG-3′，并依照该通则中COⅠ序列扩增程序实验（即94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，5个循环；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min）。电泳结果显示驴、骡的条斑不清晰，说明驴、骡的PCR产物均未能扩增出质量较高的DNA，无法进行测序分析。采用新设计的引物，并调整PCR反应条件中72 ℃ 1.5 min为72 ℃ 5 min，所有样品均可扩增出DNA，条带清晰，并测序成功。

4.4 杂交后代骡序列的探讨

驴与同科动物马杂交的后代骡有驴骡和马骡之分，由于驴骡农业上少用，仅收集到1批样品。COⅠ为母系遗传^[12]，实验结果3批马骡样品与马聚类到一起，1批驴骡样品与驴聚到一起，说明马骡与马的亲缘关系很近，尚未达到分化的水平；驴骡与驴的种间遗传距离虽为0.063，大于0.20，但聚类分析仍未将两者明显区分。目前在NCBI数据库中尚未检索到马骡入驴骡的COⅠ序列，驴与马及马骡可清晰区分，但与驴骡的区分还有待进一步研究摸索。