2018, Vol. 38 
黄芪桂枝五物汤是汉代张仲景所著《金匮要略》中治疗血痹症的经典方剂，原文记载“血痹阴阳俱微，寸口关上微，尺中小紧，外证身体不仁，如风痹状，黄芪桂枝五物汤主之”[1]。该方由黄芪、桂枝、芍药、生姜和大枣共5味药材组成，具有益气温经及和血通痹的功效。研究表明，黄芪桂枝五物汤具有抗炎镇痛，增强免疫，保护心脑血管，抗冻伤，神经保护等多种生物活性，临床上广泛用于骨关节炎、糖尿病周围神经病变、冠心病、脑梗、颈椎病、皮肤瘙痒症、冻伤等疾病的治疗[2-4]。
黄芪桂枝五物汤的配方体现了中药复方君臣佐使的思想，方中黄芪益气固卫，振奋阳气为君药，桂枝温经通阳，协黄芪达表而运行气血为臣药，芍药养血和营为佐药，生姜祛散风邪，大枣调和营卫为使药。黄芪中主要含有毛蕊异黄酮苷等黄酮类成分和黄芪甲苷等皂苷类成分，具有增强免疫力，促进血液循环等功效[5-7]；桂枝中主要含有桂皮酸等有机酸类成分，具有抑菌、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒、利尿等功效[8-9]；芍药主要含有芍药苷和芍药内酯苷等单萜苷类成分，具有镇痛、解痉、抗炎和促进肌肉松弛等功效[10-11]。目前，关于黄芪桂枝五物汤的质量控制已有文献报道[12-13]，仅选择方中指标性成分黄芪甲苷进行含量测定，所采用的方法为高效液相色谱法，采用的检测器为蒸发光散射检测器（ELSD），存在操作烦琐，检测指标少，重现性差等缺点。关于黄芪桂枝五物汤中多种药材的多种成分同时测定尚未见文献报道。近年来，超快速液相色谱（ultra-fast liquid chromatography，UFLC）技术由于在峰容量、分析效率、灵敏度和分辨率方面均优于常规的HPLC法，并可在极短的时间内达到柱平衡或重新平衡，显著减少分析时间，减少了溶剂用量，降低了分析成本，已越来越多地应用于中药复方的质量控制研究[14-15]。本研究建立了同时测定黄芪桂枝五物汤中毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸含量的超快速液相色谱法，所建立的分析方法分析时间明显缩短，分析效率显著提高，可为全面评价黄芪桂枝五物汤的内在质量提供科学依据。
1 仪器与试药日本岛津公司Prominence UFLC型超高快速液相色谱仪（配备Prominence SIL-20AHT自动进样器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器，LC solution色谱工作站），昆山市超声仪器有限公司KQ-250DE型数控声波清洗器；赛多利斯仪器有限公司CPA 225D型电子天平。
乙腈和甲醇为色谱纯（美国Fisher Scientific公司），磷酸为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），所用水为经过Milli-Q型超纯水仪净化后的超纯水，其他试剂均为分析纯。对照品毛蕊异黄酮苷（批号111920-201606）和芍药苷（批号110736-201640）购自中国食品药品检定研究院，对照品芍药内酯苷（批号151109）和桂皮酸（批号150924）购自成都普菲德生物技术有限公司，纯度均大于98%。
黄芪、桂枝、芍药、生姜、大枣均购自吉林市吉林大药房，产地分别为内蒙古、安徽、广西、新疆、吉林，经吉林医药学院生药教研室李景华副教授鉴定，黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，桂枝为樟科植物肉桂Cirmarnomum cassia Presl的干燥嫩枝，芍药为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，生姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rose.的新鲜根茎，大枣为鼠李科植物枣Ziziphus Jujuba Mill.的干燥成熟果实，样本留存于吉林医药学院药学院中药样品室。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为Shim-Pack XR-ODS（75 mm×3.0 mm，2.2 μm），预柱为C18保护柱（4 mm×3.0 mm，2.2 μm），流动相为0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~5 min，10%B→20%B；5~10 min，20%B→25%B；10~15 min，25%B→35%B；15~18 min，35%B→43%B），平衡时间为5 min，流速0.4 mL·min-1，检测波长分别为232 nm（毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷）和290 nm（桂皮酸），柱温为35 ℃，进样量5 μL。典型色谱图见图 1。
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1.芍药内酯苷（albiflorin） 2.芍药苷（paeoniflorin） 3.毛蕊异黄酮苷（calycosin-7-O-β-D-glucoside） 4.桂皮酸（cinnamic acid） 图 1 混合对照品232 nm（A）、混合对照品290 nm（B）、黄芪桂枝五物汤样品232 nm（C）、黄芪桂枝五物汤样品290 nm（D）、缺黄芪的阴性样品232 nm（E）、缺黄芪的阴性样品290 nm（F）、缺芍药的阴性样品232 nm（G）、缺芍药的阴性样品290 nm（H）、缺桂枝的阴性样品232 nm（I）、缺桂枝的阴性样品290 nm（J）的UFLC色谱图 Figure 1 UFLC chromatograms of mixed reference substances at 232 nm(A), mixed reference substances at 290 nm(B), Huangqi Guizhi Wuwu decoction sample at 232 nm(C), Huangqi Guizhi Wuwu decoction sample at 290 nm(D), negative sample without Huangqi at 232 nm(E), negative sample without Huangqi at 290 nm(F), negative sample without Shaoyao at 232 nm(G), negative sample without Shaoyao at 290 nm(H), negative sample without Guizhi at 232 nm(I), negative sample without Guizhi at 290 nm(J) |
参照《金匮要略》原文，折合成现代剂量，分别称取黄芪9 g、桂枝9 g、白芍9 g、生姜18 g、大枣4枚，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入10倍量水浸泡0.5 h，回流提取1 h，放冷过滤，滤渣再加入10倍量的水回流提取1 h，放冷过滤。最后合并2次滤液，用旋转蒸发仪浓缩至50 mL，置于4 ℃冰箱中保存，备用。
2.3 溶液的制备 2.3.1 对照品储备液取毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸的对照品适量，精密称定，分别置于5 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，制成含毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸均为1.0 mg·mL-1的单一对照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，备用。
2.3.2 供试品溶液取“2.2”项下黄芪桂枝五物汤0.5 mL，置50 mL锥形瓶中，加甲醇溶液25 mL，称量，超声（功率250 W，频率50 kHz）提取30 min，放冷后再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液经0.22 μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。
2.3.3 阴性样品溶液按处方量分别制备不含黄芪的阴性样品、不含芍药的阴性样品、不含桂枝的阴性样品，分别按“2.3.2”项方法操作，即得。
2.4 线性关系考察及检测下限、定量下限测定分别精密吸取“2.3.1”项下毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸的对照品储备液适量，置于5 mL量瓶中，用甲醇配制成毛蕊异黄酮苷质量浓度为1、2、5、10、20和50 μg·mL-1，芍药苷质量浓度为10、20、50、100、200和500 μg·mL-1，芍药内酯苷质量浓度为2.5、5、12.5、25、50和125 μg·mL-1，桂皮酸质量浓度为5、10、25、50、100和250 μg·mL-1的系列混合对照品溶液，依次注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，以对照品的浓度X（μg·mL-1）为横坐标，色谱峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸的回归方程分别为：
Y=5.0×104X+1.3×104 r=0.999 7
Y=1.9×104X+1.1×104 r=0.999 8
Y=1.7×104X+2.4×104 r=0.999 8
Y=7.9×104X+3.0×104 r=0.999 7
结果表明，毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸质量浓度分别在1~50 μg·mL-1（r=0.999 7）、10~500 μg·mL-1（r=0.999 8）、2.5~125 μg·mL-1（r=0.999 8）、5~250 μg·mL-1（r=0.999 7）范围内与峰面积呈良好的线性关系。
将毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸对照品储备液逐步稀释后进样，以信噪比（S/N）为3考察其检测下限，以信噪比（S/N）为10考察其定量下限。毛蕊异黄酮的检测下限和定量下限分别为3 ng·mL-1和10 ng·mL-1，芍药苷的检测下限和定量下限分别为30 ng·mL-1和100 ng·mL-1，芍药内酯苷的检测下限和定量下限分别为7.5 ng·mL-1和25 ng·mL-1，桂皮酸的检测下限和定量下限分别为15 ng·mL-1和50 ng·mL-1。
2.5 精密度试验取“2.4”项下制备的含毛蕊异黄酮苷10 μg·mL-1，芍药苷100 μg·mL-1，芍药内酯苷25 μg·mL-1和桂皮酸50 μg·mL-1的混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸峰面积的RSD（n=6）分别为2.8%、0.61%、0.64%和0.72%，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验取同一批次的供试品溶液，放置于室温，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积。结果毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸峰面积的RSD（n=6）分别为0.51%、2.8%、2.0%和2.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验取同一批样品6份，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样5 μL，分别计算毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸的含量，结果上述4个成分的平均含量（n=6）分别为0.212、21.53、4.53和0.662 mg·mL-1，RSD分别为0.53%、1.5%、1.2%和1.9%，表明方法重复性良好。
2.8 回收率试验精密称取已知含量（毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸的含量分别为0.212、21.53、4.53和0.662 mg·mL-1）的黄芪桂枝五物汤样品溶液共9份，每份0.25 mL，精密称定，分别加入相当于样品中毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸含量的80%、100%、120%的对照品溶液适量，各3份。按“2.3.2”项下方法制备供试溶液，进样5 μL进行测定，计算毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸的回收率和RSD，结果见表 1。
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表 1 黄芪桂枝五物汤样品中毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸的回收率 Table 1 Recoveries of calycosin-7-O-β-D-glucoside, paeoniflorin, albiflorin and cinnamic acid |
按“2.2”项下方法制备6批黄芪桂枝五物汤，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样5 μL，记录峰面积，代入回归方程，计算毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸的含量。6批样品测定结果见表 2。
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表 2 黄芪桂枝五物汤样品中毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸的含量（mg·mL-1） Table 2 The contents of calycosin-7-O-β-D-glucoside, paeoniflorin, albiflorin and cinnamic acid in Huangqi Guizhi Wuwu decoction |
分别考察了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%磷酸水-甲醇、0.1%磷酸水-乙腈共6种流动相体系。结果表明，采用0.1%磷酸水-乙腈作为流动相时能够获得较好的分离效果，在该流动相条件下，毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸的分析时间仅为18 min，且药材中其他色谱峰不干扰样品的测定。
3.2 梯度洗脱程序的选择毛蕊异黄酮苷、芍药苷和芍药内酯苷的极性很相近，采用等度洗脱无法完全分离。因此，本文采用0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）作为流动相，考察了不同的梯度洗脱条件。结果表明，梯度条件设定为0~5 min，10%B→20%B；5~10 min，20%B→25%B；10~15 min，25%→35%B；15~18 min，35%B→43%B时，毛蕊异黄酮苷、芍药苷和芍药内酯苷能够很好地分离，且杂质峰无干扰。由于黄芪甲苷结构中无共轭结构，仅存在微弱的紫外末端吸收，最大吸收波长位于203 nm左右，干扰较大，常采用ELSD检测器测定，因而本实验并未考虑采用紫外检测器对黄芪甲苷进行测定。
3.3 检测波长的选择采用二极管阵列检测器（DAD）进行全波长扫描，对黄芪桂枝五物汤中4个活性成分进行光谱扫描；结果表明，毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷在232 nm处有最大吸收峰，而桂皮酸的最大吸收峰在290 nm处。为了同时兼顾上述4个活性成分的测定，本研究选用232 nm和290 nm作为检测波长。
3.4 提取方法及提取溶剂的选择本实验对比了超声法和回流法对黄芪桂枝五物汤中4个活性成分的提取效果，结果表明，超声法出峰效果较好，受杂峰影响小，因此选择超声法作为黄芪桂枝五物汤的提取方法。此外，本实验对比了含水的50%、70%、100%乙腈溶液，50%、70%、100%乙醇溶液和50%、70%、100%甲醇溶液作为提取溶剂对黄芪桂枝五物汤中活性成分的提取效率，结果显示纯甲醇的综合提取效率最高，故本实验采用纯甲醇作为提取溶剂。
3.5 小结中药复方化学成分复杂，在以往的研究中常采用对君药或用药量较多的药味的主要成分进行质量控制的方法，这种方法存在一定的片面性，无法全面评价中药复方的质量。本研究建立UFLC法同时测定黄芪桂枝五物汤中毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸共4个活性成分的含量，方法稳定，重复性好，专属性强，分析时间短，可为黄芪桂枝五物汤的质量控制提供参考和依据。
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